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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002651-4

Untersuchungen zur antiallergischen Wirkung von Tricholoma populinum LANGE und Armillaria ostoyae (ROMAGN .) HERINK sowie zur Qualitätssicherung von Pilzen am Beispiel von Polysacchariden/β-Glucanen und Agaritin

  • Tricholoma populinum, der Pappel-Ritterling, ist ein einheimischer, eine Mykorrhiza mit Populus sp. ausbildender Speisepilz. Als in-vitro-Testmodell diente die Quantifizierung der Degranulation von RBL-2H3-Zellen nach Sensibilisierung mit einem IgE-Antikörper und Stimulierung mittels DNP-HSA. Anschließend wurde die Aktivität eines membranständigen Enzyms, der β-Hexosaminidase, im Überstand bestimmt. Es konnte beobachtet werden, dass der DCM-Extrakt aus Fruchtkörpern des Pappel-Ritterlings eine signifikante Inhibition der Degranulation aufwies. Nach Säulenchromatographie an offener Säule konnten aktive und nicht-aktive Fraktionen ausgemacht werden. Eine Aufreinigung des DCM-Extraktes geschah durch SPE, präparative TLC und Säulenchromatographie. Der letzte Aufreinigungsschritt geschah bei allen Substanzen durch semipräparative HPLC. Reinsubstanzen wurden mit MS- und NMR-Techniken charakterisiert. Die aus dem Pappel-Ritterling isolierten Reinsubstanzen aus den Klassen der aliphatischen Säuren und C28-Sterole wiesen einzeln keine Degranulationshemmung im in-vitro-Modell auf. Ein weiterer untersuchter Organismus war Armillaria ostoyae, der Dunkle Hallimasch. Auch der DCM-Extrakt aus Fruchtkörper und Myzel von A. ostoyae zeigte eine signifikante Reduktion der Degranulation. Dieser Effekt konnte erstmals für A. ostoyae festgestellt werden. Fruchtkörper wurden in Wildsammlung erhalten, das Myzel kultiviert und durch molekularbiologische Untersuchung identifiziert. Aus dem Myzel des Dunklen Hallimaschs konnten Sesquiterpen-Arylester isoliert werden. Hierbei handelte es sich um die Melleolide C, H und J, Melledonal C, 10‑Hydroxymelleolide, Armillarin und Armillaridin sowie einen bisher unbekannten Naturstoff, dessen Struktur durch weitere IR- und CD-spektroskopische Untersuchungen bestätigt werden sollte. Des Weiteren wurde auch das Fettsäure-Derivat Linolsäure-Methylester isoliert und mittels NMR identifiziert. Die Substanzen Melleolide H und J verminderten die Degranulation von RBL-2H3-Zellen, Linolsäure-Methylester wies diesen Effekt nicht auf. Eine Zytotoxizitäts-Untersuchung von Extrakten und Reinsubstanzen wurde mittels des Neutral-Red-Uptake-Assay durchgeführt. Die Extrakte von T. populinum und A. ostoyae zeigten zytotoxische Wirkungen. Nach 24 h Inkubationszeit war diese deutlich stärker als nach 1 h. Auch die isolierten Reinsubstanzen wiesen eine Zytotoxizität auf. Der zytotoxische Effekt kann nicht für die Verminderung der Degranulation verantwortlich gemacht werden. Schädigende Effekte wären bereits im Degranulationsassay sichtbar, konnten jedoch bei Konzentrationen um den IC50-Wert nicht beobachtet werden. Der DCM-Extrakt aus dem Fruchtkörper des Pappel-Ritterlings zeigte einen inhibierenden Einfluss auf die Interleukin-2-Freisetzung stimulierter Jurkat-T-Zellen. Die in der mykologischen Literatur als essbar deklarierten Arten T. populinum und A. ostoyae könnten mittel- bis langfristig zumindest unterstützend bei allergischen Reaktionen Anwendung finden. Bei den Untersuchungen zur Qualitätssicherung standen Methoden zur Gehaltsbestimmung von Polysacchariden, β-Glucanen und Agaritin im Mittelpunkt. Diese wurden etabliert, optimiert und validiert. Einen guten Überblick über allgemeine Kohlenhydratgehalte gibt die Anthron-Methode. Bei dieser werden Polysaccharide hydrolysiert und zu Furfuralen umgewandelt, welche mit Anthron zu einem photometrisch bestimmbaren Produkt reagieren. Validierung erwies die Methode als geeignet für die Bestimmung des Gehaltes von Polysacchariden in Pilzextrakten. Weitergehende Informationen über die dreidimensionale Struktur der in Extrakten enthaltenen β-Glucane können durch die Anilinblau-Fluoreszenz-Methode erhalten werden. Die Methode erwies sich als selektiv für β-1,3-d-Glucane und bewies auch bei Untersuchung anderer Validierungsparameter ihre Eignung für eine β-Glucan-Gehaltsbestimmung. Mit der Kongorot-Methode sollen verzweigte β-1,3;1,6-d-Glucane erfasst werden. Diesen Glucanen wird häufig eine immunologische Aktivität zugerechnet. Allerdings erwies sich die Kongorot-Methode für die Informationsgewinnung über eine 3D-Struktur als weniger geeignet, da ihre Sensitivität zu gering und ihre Selektivität zu schwach ausgeprägt ist. Agaritin als Substanz mit interessanten und widersprüchlichen biologischen Effekten. Es wurde eine Methode etabliert, bei der Agaritin aus pulverisierten Fruchtkörpern extrahiert, durch SPE aufgereinigt und mittels LC-MS/MS und MRM im positiven Ionisationsmodus bestimmt wurde. Die Quantifizierung geschah mithilfe der Extern-Standard-Kalibration mit Agaritin als Referenzsubstanz. Die untersuchte Methode ist dazu geeignet, Agaritin zu quantifizieren, was durch die durchgeführte Validierung belegt wurde.
  • Tricholoma populinum is an edible mycorrhiza-building fungus in relation with Populus sp. In 1977 mushroom collector Herbert Schäfer published an article about the effects of T. populinum on thrombangitis obliterans and allergic rhinitis. For in-vitro tests, quantification of degranulation of RBL-2H3-cells after stimulation with DNP-HSA following sensibilisation with IgE was used. Subsequently, the activity of the membrane-bounded enzyme β‑hexosaminidase in the supernatant was measured. It could be found, that DCM extracts from fruiting bodies of T. populinum exhibited a significant inhibition of degranulation. Gravity-driven column chromatography yielded active and non-active fractions. Purification of the DCM extracts was done by SPE, preparative TLC and column chromatography. The last purification step was semipreparative HPLC for all substances. Pure compounds were characterized by mass spectrometry and nuclear magnetic resonance techniques. Therewith, oleic acid, ergosterolperoxide, 9,11‑Dehydroergosterolperoxide and cerevisterol were identified. Single compounds isolated from T. populinum belonging to the classes of aliphatic acids and C28-sterols showed no activity in the in-vitro assay. Another organism investigated was Armillaria ostoyae, which is also used as food. In contrast to symbiotically living T. populinum, A. ostoyae is a parasitic and saprophytic fungus. DCM extracts from fruiting bodies and mycelia exhibited significant reduction of degranulation. This effect could be observed for the first time in A. ostoyae. Fruiting bodies were collected by wild harvesting. Cultivated mycelia was identified by molecular biological experiments. Sesquiterpene-arylesters melleolides C, H and J, melledonal C, 10‑Hydroxymelleolide, armillarin and armillaridin as well as an unknown natural product were obtained from the mycelia of A. ostoyae. The structure of the new compound should be confirmed by IR- and CD-spectroscopy. Further, methyl linoleate was purified and characterized by NMR. The melleolides H and J decreased the degranulation of RBL-2H3 cells, methyl linoleate did not show this effect. Cytotoxicity-testing of extracts and pure compounds was done by neutral red uptake-assay. Extracts as well as single substances from T. populinum and A. ostoyae showed cytotoxic activity, which was considerably stronger after 24 h than after 1 h. The cytotoxic effect is not responsible for the decrease of degranulation. Damaging effects could be visible in the degranulation assay but were not observed in concentration around IC50. The DCM extract of fruiting bodies of T. populinum exhibited an inhibiting influence on the Interleukin-2 release of stimulated Jurkat-T-cells (a tumorigenic T cell line). T. populinum and A. ostoyae are accounted as edible in mycological literature and could play at least a supporting role in the treatment of allergic reaction in the middle- or long-term. In the investigation respecting quality assurance, focus was on methods for the quantification of polysaccharides, β-glucans and agaritine. These methods were established, optimised and validated. An overview on carbohydrate content can be get by the anthrone method. Polysaccharides are hydrolysed and converted to furfurals, which react with anthrone to photometrically measurable products. Validation showed this method to be suitable for determination of polysaccharide contents in mushroom extracts. Further information about the three-dimensional structure of β-glucans in extracts can be obtained by the aniline blue fluorescence method. The method showed to be selective for β-1,3-d-glucans and other validation parameters also proved its appropriateness for a quantification of β-glucan content. With the congo red method cross-linked β-1,3;1,6-d-glucans are said to be measured. Immunological activity often is ascribed to these glucans. The method is less suitable for the producing of informations on three-dimensional structures, because its sensitivity is very low and selectivity is also poor. Agaritine, a substance with interesting and inconsistent biological effect. In this method, agaritine is extracted from pulverized fruiting bodies, purificated by solid phase extraction and measured by LC-MS/MS with multiple reaction monitoring in positive ionization mode. Quantification was done by external standard calibration with pure agaritine as reference substance. The method is able to quantificate agaritine validly.

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Metadaten
Author: Simon Merdivan
URN:urn:nbn:de:gbv:9-002651-4
Title Additional (English):Antiallergic effects of Tricholoma populinum LANGE and Armillaria ostoyae (ROMAGN.) HERINK and quality control of mushrooms exemplificated by polysaccharides/β-glucans and agaritine
Advisor:Prof. Dr. Ulrike Lindequist
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2016/11/02
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2016/10/26
Release Date:2016/11/02
Tag:Armillaria ostoyae, Pappel-Ritterling, Tricholoma populinum
allergy, degranulation, mushrooms, phytochemistry, quality assurance
GND Keyword:3->, Agaritin, Allergie, Glucane <beta-1, Hallimasch, Immunsuppression, Phytochemie, Pilze, Polysaccharide, Qualitätssicherung
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Pharmazie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 540 Chemie
MSC-Classification:92-XX BIOLOGY AND OTHER NATURAL SCIENCES / 92-02 Research exposition (monographs, survey articles)