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Dana Schönherr

• Die Applikation von Arzneistoffen erfolgt sehr häufig über die orale Gabe. Die Kenntnis der Arzneistoffkonzentration im humanen Darm ist somit essentiell für das Verständnis der oralen Arzneimitteltherapie. Die intestinale Absorption wird von verschiedenen Faktoren bestimmt. Dazu gehören die anatomischen und physiologischen Gegebenheiten des Gastrointestinaltraktes sowie die Eigenschaften des Arzneistoffes und der Arzneiform. Das komplexe Zusammenspiel dieser Faktoren kann die intestinale Konzentration des Arzneistoffes und folglich dessen Absorption und daraus abgeleitet Wirkung und Nebenwirkung beeinflussen. Zur Bestimmung der intraluminalen Arzneistoffkonzentration und zur Charakterisierung des zugehörigen Absorptionsprozesses werden bisher Systeme und Methoden verwendet, welche die Physiologie des Darmes beeinflussen können oder die im Rahmen einer chirurgischen Intervention angewendet werden. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung und Charakterisierung eines Mikrodialysesystems zur Bestimmung intraluminaler Arzneistoffkonzentrationen im humanen Dünndarm. Dabei sollte das System die positiven Eigenschaften der bisher verwendeten Methoden und Systeme kombinieren. Die verwendeten Materialien wurden so ausgewählt, dass ein flexibles aber dennoch robustes System aus biokompatiblen Bestandteilen erhalten wurde. Das entwickelte System kann zudem mit bildgebenden Verfahren, wie der MRT, kombiniert werden. Das neu entwickelte Mikrodialysesystem besteht letztendlich aus einer Mikrodialyseeinheit sowie einem Zufluss- und Ablaufschlauch. Die finale Mikrodialyseeinheit ist aus 30 semipermeablen Kapillaren mit einer Austauschlänge von 10 cm zusammengesetzt, über die der Stoffaustausch zwischen dem Perfusat als Akzeptor-Kompartiment und dem Medium als Donor-Kompartiment erfolgt. Das System kann hierbei kontinuierlich oder diskontinuierlich perfundiert werden. Für den diskontinuierlichen Perfusatfluss war es hierbei nötig, einen zusätzlichen Schlauch in das System zu integrieren, der ein Abtrennen der gewonnenen Proben im Ablaufschlauch mittels Luftblasen ermöglicht. Die vorgesehene Anwendung des Mikrodialysesystems in klinischen Studien am Menschen wurde bei dessen Entwicklung stets berücksichtigt. Die Einbettung der Mikrodialyseeinheit in ein Schlauchsystem ermöglicht die orale Applikation und vereinfacht damit die Anwendung des Mikrodialysesystems im Menschen. Mit der Kombination von zwei Mikrodialysesystemen in einem Set kann weiterhin die gleichzeitige Erfassung von intraluminalen Arzneistoffkonzentrationen in unterschiedlichen Abschnitten des humanen Darmes erfolgen. Nach der erfolgreichen Entwicklung des Mikrodialysesystems erfolgte zunächst die Charakterisierung der Funktionalität des Systems anhand der relativen Wiederfindung des Arzneistoffes in den Dialysatproben. Die Untersuchungen wurden mit den Arzneistoffen Paracetamol, Amoxicillin-Trihydrat und Valsartan, die aufgrund ihres spezifischen Absorptionsverhaltens im Gastrointestinaltrakt ausgewählt wurden, und verschiedenen biorelevanten Donor-Medien sowie Perfusaten durchgeführt. Das Mikrodialysesystem wurde dabei kontinuierlich oder diskontinuierlich vom Perfusat durchströmt. Bei Verwendung des kontinuierlichen Perfusatflusses wurden jedoch vergleichsweise geringere Werte für die relative Wiederfindung bestimmt. Die Verwendung des diskontinuierlichen Perfusatflusses resultierte dagegen in einer Equilibrierzeit von 1 bis 60 min, welches einen verlängerten Stoffaustausch zwischen dem Donor-Kompartiment und dem Perfusat ermöglichte und somit zu deutlich höheren relativen Wiederfindungen führte. Außerdem wurden die Proben im Ablaufschlauch unverzüglich durch die Zufuhr von Luft, die über den zusätzlich enthaltenen Schlauch zugeführt wurde, separiert. Ein Anstieg der Equilibrierzeit von 1 auf 5 oder 60 min resultierte hierbei allerdings nicht in einer deutlichen Erhöhung der relativen Wiederfindung. Für Amoxicillin und Valsartan wurden ähnliche Werte für die relative Wiederfindung bestimmt, während für Paracetamol höhere Werte ermittelt wurden, die mit dem geringeren Molekulargewicht und der damit verbundenen erhöhten Diffusionsgeschwindigkeit erklärt werden können. Nachdem ein deutlicher Einfluss der Temperatur auf die relative Wiederfindung nachgewiesen wurde, erfolgte die Durchführung der In vitro-Untersuchungen ausschließlich bei Körpertemperatur. Die Sensitivität des Mikrodialysesystems wurde untersucht, um dessen Eignung für In vivo-Untersuchungen zu bestimmen. Dabei sollte geprüft werden, ob und wie schnell Änderungen der Arzneistoffkonzentration im Donor-Kompartiment in den Dialysatproben nachweisbar sind. Bei Anwendung des kontinuierlichen Perfusatflusses erfolgte die Detektion der Erhöhung und Verringerung der Stoffkonzentration im Donor-Kompartiment verzögert. Im Gegensatz dazu konnte bei Nutzung des diskontinuierlichen Perfusatflusses mit einer Equilibrierzeit von 1 min eine Konzentrationsänderung im Donor-Kompartiment sofort in der nachfolgend gewonnenen Dialysatprobe nachgewiesen werden. Dies wurde für alle verwendeten Arzneistoffe bestätigt, sodass alle nachfolgenden Untersuchungen mit dem diskontinuierlichen Perfusatfluss und einer Equilibrierzeit von 1 min durchgeführt wurden. In den folgenden Untersuchungen wurde nachgewiesen, dass das Mikrodialysesystem mehrmalig für In vitro-Untersuchungen genutzt werden konnte. Anhand von acht untersuchten Mikrodialysesystemen für Paracetamol und jeweils vier Mikrodialysesystemen für Amoxicillin und Valsartan konnte die reproduzierbare Herstellung der Mikrodialyse¬systeme nachgewiesen werden. Die Verwendung unterschiedlicher Donor-Medien und Perfusate führte zu ähnlichen Ergebnissen. Die anatomischen Gegebenheiten des Dünndarms wurden durch Untersuchungen in einem Röhrenmodell simuliert. Erhöhungen oder Verringerungen der Konzentration im Donor-Kompartiment wurden auch bei dieser Versuchsanordnung ohne zeitliche Verzögerung in der darauffolgenden Dialysatprobe nachgewiesen. In Zusammenarbeit mit dem Medizinproduktehersteller RoweMed erfolgte anschließend die Adaption des Mikrodialysesystems an die humane Anwendung. Dabei wurden modifizierte Bestandteile, wie zum Beispiel Schläuche mit verringerten Durchmessern verbaut, um die Anwendung für den Probanden möglichst angenehm zu gestalten. Die Möglichkeit, die Lokalisation der Mikrodialyseeinheit im Gastrointestinaltrakt über die pH-metrische Analyse der Dialysatproben zu bestimmen, wurde anschließend untersucht. Bis zu einem pH-Wert von pH 3 kann über den erniedrigten pH-Wert in den Dialysatproben der Rückschluss auf die Lage im Magen gezogen werden. Dies entspricht dem üblicherweise ermittelten pH-Wert im Magen von pH 2,7 bei nüchternen jungen, gesunden Probanden. Abschließend wurde die Eignung der Braun Infusomat® und Perfusor® Space Pumpen, die zur humanen Anwendung zugelassen sind, für die Nutzung in Kombination mit dem Mikrodialysesystem überprüft, um in einer Studie am Menschen CE-zertifizierte Geräte einsetzten zu können. Die beschränkte Programmierbarkeit beider Pumpen bei der Anwendung des diskontinuierlichen Perfusatflusses erforderte eine erneute Modifikation des Versuchsablaufes. Durch die Reduktion der Pump- und Equilibrierzeiten konnte ein Versuchsablauf ermittelt werden, der ähnliche Ergebnisse wie mit den bisher verwendeten Pumpen lieferte. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Mikrodialysesystem zur Bestimmung intestinaler Arzneistoffkonzentrationen entwickelt und in vitro charakterisiert. Die mit dem Mikrodialysesystem gewonnenen Daten könnten genutzt werden, um zukünftig das komplexe Zusammenspiel verschiedener Faktoren während der Arzneistoffabsorption besser zu verstehen. Mit diesem Wissen könnten Nebenwirkungen und Wechselwirkungen oral applizierter Arzneistoffe verringert und deren Bioverfügbarkeit erhöht werden.
• The most common route of drug administration is the oral route. Therefore, knowledge of intestinal drug concentration is important for understanding of oral drug therapy. The intestinal absorption is influenced by various factors. These are the anatomical and physiological conditions of the gastrointestinal tract as well as physicochemical characteristics of the drug substance and dosage form. The complex interaction of these factors can affect the intestinal concentration of the drug substance and therefore its absorption as well as effects and side effects. For the determination of intraluminal drug concentration and the characterization of the respective absorption process systems and methods that can affect the physiology of the gut or that are applied as part of a surgical intervention were used until now. The aim of this work was the development and characterization of a microdialysis system for determination of intraluminal drug concentrations in the human small intestine. The system should combine the positive features of the methods and systems used up to now. The materials used were chosen to obtain a flexible but robust system made from biocompatible components. The newly developed system can also be combined with imaging techniques such as MRI. The novel microdialysis system finally consists of a microdialysis unit and an inlet and outlet tube. The final microdialysis unit is made up of 30 semi permeable capillaries with a length of 10 cm where an exchange of drug substance between the perfusate as acceptor compartment and the medium as donor compartment can occur. The novel system can be perfused either continuously or discontinuously. For the discontinuous flow of perfusate an additional tube was incorporated into the system, which allows a separation of the samples in the outlet tube via air bubbles. The intended use of the microdialysis system in human clinical trials has always taken into account throughout its development. Embedding the microdialysis unit in a tube system allows the oral administration and thus simplifies the use of the microdialysis system in human beings. With the combination of two microdialysis systems in a set, the simultaneous detection of intraluminal drug concentrations can be performed in different parts of the human intestine. The successful development of the microdialysis system was followed by the characterization of the functionality of the system, which was determined as relative recovery of the drug substance in the dialysate samples. The experiments were carried out with the drug substances paracetamol, amoxicillin trihydrate and valsartan, which were selected due to their specific absorption behavior in the gastrointestinal tract, and various biorelevant donor-media and perfusates. The microdialysis system was continuously or discontinuously flown by the perfusate. Slightly lower values were determined for the relative recovery when using the continuous flow. However, the use of discontinuous flow resulted in an equilibration time of 1 to 60 minutes, which resulted in a prolonged exchange of drug substance between the donor compartment and the perfusate and thus led to higher relative recoveries. In addition, the samples in the outlet tube were immediately separated by air which has been supplied via the additional tube. An increased equilibration time of 5 or 60 min did not resulted in significant higher relative recoveries. For amoxicillin and valsartan similar values for relative recovery were obtained, while for paracetamol higher values were determined, which can be explained by the lower molecular weight associated with an increased diffusion rate. Since a significant influence of temperature was detected on the relative recovery, the following vitro studies were conducted at body temperature. The sensitivity of the microdialysis system was examined to determine its suitability for in vivo studies. It should be investigated whether and how fast changes in drug concentration in the donor compartment can be detected in the dialysate. When using the continuous flow the detection of increase and decrease of the drug concentration in the donor compartment was delayed. In contrast, the use of discontinuous flow with an equilibration time of 1 min resulted in detection of concentration change in the donor compartment immediately in the subsequently generated dialysate sample. This was confirmed for all drug substances used and therefore all subsequent studies were performed with the discontinuous flow of perfusate and an equilibration time of 1 min. The following studies demonstrated that the microdialysis system could be used multiple times for in vitro studies. Based on eight examined microdialysis systems for paracetamol and four microdialysis systems for amoxicillin and valsartan each the reproducible production of the microdialysis system could be confirmed. The use of different donor media and perfusates led to similar results. The anatomical conditions of the small intestine were simulated by tests in a tube model. An increase or decrease in the concentration in the donor compartment was in this experimental setup also detected without delay in the subsequent dialysate sample. In cooperation with the medical device manufacturer RoweMed the microdialysis system was adapted for human use. Therefore, modified components e.g. tubes with reduced diameters were used in order to make the application for the volunteers as comfortable as possible. The ability to determine the localization of the microdialysis unit in the gastrointestinal tract over pH-metric analysis of the dialysate was analyzed afterwards. Up to a pH value of pH 3 the localization in the stomach can be made over the decreased pH value in the dialysate. This corresponds to the commonly found pH values of pH 2.7 in the stomach of fasted young healthy subjects. Finally, Braun Infusomat® and Perfusor® Space pumps that are approved for human use, are tested for use in combination with the microdialysis system, to use CE certified devices in a human study. The limited programmability of both pumps when applying the discontinuous flow required a modification of the experimental procedure. By reducing the time for pumping and equilibration an experimental procedure could be determined which led to similar results in comparison to the pumps used until now. In this work a microdialysis system for the determination of intestinal drug concentrations was developed and characterized in vitro. All data obtained with the microdialysis system could be used in the future to better understand the complex interplay of various factors during drug absorption. With this knowledge, side effects and interactions of orally administered drug substances could be reduced and their bioavailability could be increased.