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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-000607-1

Auslösung intrazellulärer Signaltransduktion und früher Genregulation in immortalisierten Atemwegsepithelzellen (S9) durch Virulenzfaktoren von Staphylococcus aureus

  • Das Gram-positive Bakterium Staphylococcus aureus besiedelt die menschliche Haut und die oberen Atemwege, z.B. die Nase. Aus noch unbekannten Gründen können die Bakterien gelegentlich einen pathogenen Charakter entwickeln und Krankheiten wie Furunkulose, Pneumonien oder Sepsis verursachen. Dieses pathogene Potenzial in Verbindung mit dem Auftreten von zahlreichen Antibiotika-Resistenzen in vielen klinisch relevanten S. aureus-Stämmen stellt ein Risiko für die menschliche Gesundheit dar. Deshalb ist es notwendig, potenzielle Effekte der bakteriellen Produkte, die die eukaryotischen Wirtszellen relevanter Organsysteme beeinflussen könnten, zu erforschen. Ziel dieser Arbeit war es deshalb, spezifische Elemente der frühen Signaltransduktion, der Genregulation und der physiologischen Antworten von humanen immortalisierten Atemwegsepithelzellen (S9) auf Kontakt mit Staphylococcus aureus-Zellkulturüberständen sowie rekombinant hergestellten individuellen Virulenzfaktoren (Hämolysin A (Hla, ein porenformendes Toxin) und Hämolysin B (Hlb, ein Enzym mit Sphingomyelinase-Aktivität)) zu untersuchen. Diese Ansätze dienen dazu, Hinweise auf die Identität sezernierter Stoffwechselprodukte von S. aureus zu erhalten, die in den eukaryotischen Wirtszellen zu direkten Abwehr- oder Vermeidungsreaktionen (angeborene Immunität) oder zu Bakterien-induziertem „Fehlverhalten“ führen, das möglicherweise (Mit-)Ursache der Pathogenität einiger Stämme des Bakteriums ist. Quantitative Western-Blot-Analysen mit löslichen Proteinextrakten von S9-Zellen offenbarten dabei eine Aktivierung der Erk-Typ-MAPK, der p38 MAPK und der Akt1/3, aber keine Aktivierung der c-Jun N-terminalen Kinase (JNK) oder Akt2 infolge der Behandlung mit steril-filtrierten S. aureus-Überständen aus der exponentiellen Wachstumsphase (OD540nm = 1), der stationären Wachstumsphase (OD540nm = 10) bzw. nach der Behandlung mit rekombinant hergestellten S. aureus Hämolysinen (rHla, rHlb). Analysen der Produkte sogenannter „früher Gene“ zeigten eine moderate Erhöhung der Expression von c-Jun und Egr-1, und eine stärkere Erhöhung der Expression von c-Fos nach der Behandlung der S9-Zellen mit den bakteriellen Überständen oder rekombinanten Toxinen (rHla, rHlb). Da Atemwegsepithelzellen bei Kontakt mit potenziell pathogenen Bakterien bzw. sekretorischen Faktoren dieser Bakterien Chemokine zur Rekrutierung von Neutrophilen sekretieren, (speziell IL-8), wurde ein Multiplex-Assay-System eingesetzt, mit dem es möglich war, 11 verschiedene Zytokine im Kulturüberstand der S9-Zellen nach Behandlung der Zellen mit den bakteriellen OD10-Überständen bzw. rekombinanten Hla oder Hlb zu analysieren. Die S9-Zellen reagierten dabei auf die Behandlung mit dem Überstand, Hla oder Hlb mit der Sekretion der pro-inflammatorischen Zytokine IL-8, IFN-γ und IL-6, und diese Zytokin-Expression wurde teilweise vermittelt über die Signalwege der Erk-Typ-MAPK und der p38 MAPK. Weiter konnte gezeigt werden, dass Atemwegsepithelzellen infolge der Behandlung mit bakteriellem Überstand bzw. Hla Zellformveränderungen unterliegen und ihre Integrität verlieren. Dieses könnte parazelluläre Wege im Epithel öffnen, und so den Bakterien ermöglichen, ins Innere des Wirtskörpers vorzudringen.
  • The Gram-positive bacterium Staphylococcus aureus settles on human skin and colonizes the upper respiratory tract, e.g. in the nose. For as yet unspecified reasons, the bacteria occasionally develop a pathogenic character and cause diseases as furunculosis, pneumonia or even sepsis. This pathogenic potential in conjunction with the occurrence of resistance against a wide range of antibiotics in many clinically relevant S. aureus-strains poses a risk to human health. Therefore, it is necessary to investigate potential effects of bacterial products that may interfere with eukaryotic host cells in relevant organ systems. The aim of this work was therefore to study signal transduction, early gene regulation and physiological responses of immortalized human airway epithelial cells (S9) to complex mixtures of secretory factors of Staphylococcus aureus or individual recombinant virulence factors (hemolysin A (Hla, a pore-forming toxin) and hemolysin B (Hlb, an enzyme with sphingomyelinase activity)). These experiments are designed to identify relevant components of the bacterial secretome which induce direct responses related to defense (innate immune response) or avoidance in eukaryotic host cells or may induce inadequate reactions that may be part of the cause of pathogenicity of specific strains of Staphylococcus aureus in humans. Quantitative Western blot analysis of soluble proteins extracted from S9 cells showed an activation of Erk-type MAPK, p38 MAPK and Akt1/3, but no activation of N-terminal Jun kinase (JNK) or Akt2 upon treatment of cells with sterile-filtered S. aureus-culture supernatants from the exponential growth phase (OD540nm = 1) or stationary growth phase (OD540nm = 10) or with recombinant S. aureus-hemolysins (rHla, rHlb), respectively. The analysis of the early gene products c-Jun and Egr-1 revealed moderate enhancements in expression and the results revealed a stronger enhancement in Expression of c-Fos upon treatment of S9-cells with the bacterial supernatants or recombinant hemolysins (rHla, rHlb). Upon contact with potentially pathogenic bacteria or secreted factors of these bacteria, respectively, airway epithelial cells start to secrete neutrophil-attracting chemokines, especially IL-8. Therefore we used a multiplex assay system to analyze 11 different candidate cytokines in the culture supernatants of S9-cell cultures upon treating the cells with bacterial OD10-supernatants or recombinant Hla or Hlb, respectively. S9-cells responded to treatment with secretion of the pro-inflammatory cytokines IL-8, IFN-γ and IL-6, and this cytokine expression was in part mediated by Erk-type-MAPK and p38 MAPK signalling pathways. Furthermore, airway epithelial cells undergo changes in cell shape and may lose tight junction integrity after treatment with bacterial supernatant or Hla, respectively. This may open paracellular pathways in the epithelium and allow bacteria to slip in the internal space of the host’s body.

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Metadaten
Author: Sabine Below
URN:urn:nbn:de:gbv:9-000607-1
Title Additional (English):Activation of intracellular signal transduction and early gene regulation in immortalized airway epithelial cells (S9) by virulence factors of Staphylococcus aureus
Advisor:Prof. Dr. Jan-Peter Hildebrandt
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2009/04/29
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2009/04/17
Release Date:2009/04/29
GND Keyword:Hämolysin, Staphylococcus aureus
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Zoologisches Institut und Museum
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 590 Tiere (Zoologie)