Open Access

Erik Richter

• Bacterial infections represent an increasing threat in human health and hospital- acquired infections meanwhile account for 99,000 deaths every year in the United States (Ventola, 2015). Live-threating bacterial infections will certainly emerge to an even more serious concern in future, essentially by accelerated development of antibiotic resistance. Only recently, the discovery of plasmid-encoded mcr-1, that confers resistance against colistin, marks the point where this highly transmissible resistance mechanism is now reported for every so far developed antibiotic (Liu et al., 2016). Staphylococcus aureus is a Gram-positive bacterium and well-known for its ability to quickly acquire resistance toward antibiotics either by chromosomal mutations and/or horizontal gene transfer (Pantosti et al., 2007). Although approximately 30% of the population is colonized with S. aureus (Kluytmans et al., 1997), it can transform to an invasive pathogen that causes a wide range of severe infections including pneumonia. The success of S. aureus as opportunistic pathogen can be attributed to combinations of several beneficial properties and capabilities including the expression of an arsenal of virulence factors (Archer, 1998), intracellular persistence (Garzoni & Kelley, 2009) and subversion of host cell defense mechanisms (Schnaith et al., 2007). The airway epithelium is the first line of defense against bacterial pathogens by forming a relative impermeable physical barrier composed of epithelial cells that are linked by tight junctions, desmosomes and adherence junctions (Davies & Garrod, 1997). Additionally, the airway epithelium mediates the detection of bacterial pathogens via toll-like receptors (TLRs) that recognize a variety of bacterial molecular patterns such as lipopolysaccharide (LPS), peptidoglycan and flaggelin (Sha et al., 2012). This interaction is transduced via protein phosphorylations into the cell in order to promote adaptation to the infection by initiation of the adaptive and innate immune defense. Although few insights where obtained of the signaling host responses towards staphylococcal infections (Agerer et al., 2003; 2005; Ellington et al., 2001), a comprehensive description of the host signaling network is largely missing. Thus, this dissertation thesis focuses on the decipherment of phosphorylation-mediated signaling responses towards S. aureus infections in non- professional and professional phagocytes by mass spectrometry-based phosphoproteomic techniques. The results of this thesis are summarized in the four chapters. Chapter I introduces to recent advances in the development of methodologies applied in the field of phosphoproteomics, including quantification strategies, peptide fractionation techniques and phosphopeptide enrichment methods applied for the system-wide characterization of protein phosphorylations by mass spectrometry. Additionally, publications reporting phosphorylation-based host signaling responses towards bacterial pathogens or their molecular patterns that applied mass spectrometry-based phosphoproteomics are discussed. In chapter II, the responses of the human bronchial epithelial cell lines 16HBE14o- and S9 following challenge with staphylococcal alpha- toxin at the level of proteome and phosphoproteome are summarized. General and cell type-specific signaling events are highlighted and evidences linking the activity of the epidermal growth factor receptor (EGFR) with differences in tolerance toward alpha-toxin are provided. Chapter III describes the modulation of the host signaling network of 16HBE14o- airway epithelial cells triggered by infection with S. aureus including temporal dissection of signaling events. Several protein kinases were identified as important signaling hubs mediating the host response. Targeted pharmaceutical inhibition of these kinases was probed and resulted in reduction of intracellular bacterial load. Chapter IV describes the rearrangement of the kinome by the differentiation of THP-1 monocytes to macrophage-like cells by application of quantitative kinomics. This approach identified the kinase MAP3K7 (TAK1) as key mediator of bacterial clearance, chemokine secretion and the differentiation process itself.
• Bakterielle Infektionen stellen im zunehmend Maße ein Gesundheitsproblem dar, wobei inzwischen 99 000 Todesfälle jedes Jahr in den Vereinigten Staaten von Amerika zu verzeichnen sind (Ventola, 2015). Lebensbedrohliche bakterielle Infektionen werden in Zukunft zu einer noch größere Problematik werden, insbesondere durch eine beschleunigte Entwicklung von Resistenzen gegenüber Antibiotika. Erst kürzlich wurde das plasmidcodierte Gen mcr-1 beschrieben, welches Resistenz gegenüber Colistin vermittelt beschrieben werden (Liu et al., 2016). Damit wurden Resistenzen gegenüber allen entwickelten Antibiotika nachgewiesen. Staphylococcus aureus ist ein Gram-positives Bakterium welches für seine Fähigkeit bekannt ist, schnell Resistenten gegenüber Antibiotika zu entwickeln. Die Resistenzentwicklung kann dabei sowohl durch chromosomale Mutationen sowie durch horizontalen Gentransfer begründet sein (Pantosi et al., 2007). Etwa 30% der menschlichen Population ist mit S. aureus kolonisiert (Kluytmans et al., 1997) und dabei kann S. aureus zu einem invasiven Pathogen transformieren, dass eine Vielzahl von schweren Erkrankungen hervorrufen kann, wie z.B. Pneumonie. Dabei kann die erfolgreiche opportunistische Lebensweise auf eine Kombination von verschiedenen Eigenschaften und Fähigkeiten von S. aureus zurückgeführt werden. Hierbei zählen unter anderen die Expression einer Vielzahl von Virulenzfaktoren (Archer, 1998), intrazelluläre Persistenz (Garzoni&Kelly, 2009) und die Störung von der Abwehrmechanismen von Wirtszellen (Schnaith et al., 2007). Das Atemwegsepithel ist die erste Abwehrlinie gegen bakterielle Pathogene indem es eine weitgehend impermeable physische Barriere darstellt die aus Epithelzellen besteht, welche durch Tight Junctions, Desmosomen und Adherence Junctions miteinander dicht verknüpft sind. Darüber hinaus vermittelt es die Erkennung von bakteriellen Pathogenen über Toll-like Rezeptoren (TLRs), welche eine Vielzahl von molekularen Mustern bakteriellen Ursprungs erkennen, darunter Lipopolysaccharide (LPS), Peptidoglykane und Flagellin (Sha et al., 2012). Diese Interaktionsereignisse werden durch Proteinphosphorylierungen in die Wirtszelle weitergeleitet um das adaptive und angeborenen Immunsystem zu aktivieren. Obwohl bereits einige Erkenntnisse der durch S. aureus ausgelösten Wirtsantwort auf der Ebene der Signaltransduktion gewonnen werden konnten (Agerer et. al, 2003;2005; Ellington et al, 2001), wurde eine umfassende Beschreibung noch nicht durchgeführt. Entsprechend lag das Hauptaugenmerk dieser Dissertation in der Charakterisierung der Phosphorylierungs-basierte Signaltransduktion von professionelle und nicht-professionelle Phagozyten nach S. aureus Infektion mittel Massenspektrometrie-basierter Phosphoproteomik. Die Ergebnisse sind in den vier Kapiteln dieser Arbeit zusammengefasst. Kapitel 1 führt in die jüngsten Methodenentwicklungen in Bereich der Phosphoproteomik ein, darunter Strategien der Quantifizierung, Peptid Fraktionierung und Phosphopeptidanreicherung die Anwendung in der systemweiten Charakterisierung von Proteinphosphorylierungen mittels Massenspektrometrie Anwendung finden. Darüber hinaus werden Arbeiten vorgestellt in denen Massenspektometrie-basierte Phosphoproteomik angewendet wurde um die Wirtantwort auf bakterielle Pathogene oder Bestandteile bakteriellen Ursprungs zu untersuchen. Kapitel 2 beschreibt die Wirtantwort von human Bronchialepithelzelllinien 16HBE14o- und S9 nach Kontakt mit alpha-toxin von S. aureus auf Ebene des Proteoms und des Phosphoproteoms. Dabei konnten generelle aber auch zelllinienabhängige Signalereignisse festgestellt werden. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die Aktivität des epidermal growth factor receptors (EGFR) direkt mit der Toleranz gegen alpha-toxin korreliert. In Kapitel 3 wird die zeitaufgelöste Veränderung der Signalnetzwerke von 16HBE14o- Atemwegsepithelzellen nach Infektion mit S. aureus beschrieben. Verschieden Proteinkinasen konnten dabei als Signalknotenpunkte identifiziert werden die an der Signalantwort der Wirtzellen beteiligt sind. Durch gezielte pharmakologische Inhibierung dieser Proteinkinasen konnte eine Verminderung der intrazellularen Bakterien beobachtet werden. Kapitel 4 beschreibt die Umgestaltung des Kinoms durch die Differenzierung von THP-1 Monozyten zu makrophagenähnlichen Zellen durch den Einsatz von quantitativer Kinomics. Dadurch konnte die Kinase MAP3K7 (TAK1) als ein Hauptspieler bei der Beseitigung intrazellulärer Bakterien, Sekretion von Chemokinen sowie dem Differenzierungsprozess identifiziert werden.