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Nicola Fischer

• Emerging infectious diseases are among the greatest threats to human, animal and plant health as well as to global biodiversity. They often arise following the human-mediated transport of a pathogen beyond its natural geographic range, where host species are typically not well adapted due to a lack of co-evolutionary host-pathogen dynamics. One such pathogen is the fungus Pseudogymnoascus destructans (Pd), which causes White-Nose disease in hibernating bats. While Pd was first observed in North America where it has led to mass-mortalities in some bat species, the pathogen originates from Eurasia where infection is not associated with mortality. Most of the Pd research has focused on the invasive North American range, which likely underestimated the genetic structure of the pathogen and the role it might play in the disease dynamics. In my work, I therefore evaluated the genetic structure of Pd in its native range with the aim of uncovering cryptic diversity and further use population genetic data to address some key ecological aspects of the disease dynamics. With an extensive reference collection of more than 5,000 isolates from 27 countries I first demonstrated strong differentiation between two monophyletic clades across several genetic measures (multi-locus genotypes, full genome long-read sequencing and Illumina NovaSeq on isolate pools). These findings are consistent with the presence of two cryptic species which are both causative agents of bat White-Nose disease (‘Pd-1’, which corresponds to P. destructans sensu stricto, and ‘Pd-2’). Both species exist in the same geographic range and co-occur in the same hibernacula (i.e., in sympatry), though with specialised host preferences. I further described the fine-scale population structure in Eurasia which revealed that most genotypes are unique to single hibernacula (more than 95% of genotypes). The associated differences in microsatellite allele frequencies among hibernacula allowed the use of assignment methods to assign the North American isolates (exclusively Pd-1) to regions in Eurasia. Hence, a region in Ukraine (Podilia) is the most likely origin of the North American introduction. To gain further insights into the spatial and temporal dynamics of White-Nose disease on a localised scale, several hibernacula were sampled with high intensity (artificial hibernaculum in Germany and natural karst caves in Bulgaria). Low rates of Pd gene flow were observed even among closely situated hibernacula. This indicates that Pd does not remain viable on bats over summer or it would be frequently exchanged among bats (and hence hibernacula) resulting in a homogenous distribution of genotypes. Instead, bats need to become re-infected each hibernation season to explain the yearly re-occurrence of White-Nose disease. Given the distribution and richness of Pd genotypes on hibrnacula walls and infected bats of the same hibernacula, bats become infected from the hibernacula walls when they return after summer. This means that environmental reservoirs exist within hibernacula (i.e., the walls) on which Pd spores persist during bat absence and which drive the yearly re-occurrence of White-Nose disease. In an experimental setup, I confirmed the long-term viability of Pd spores on abiotic substrate for at least two years and furthermore discovered temporal variations in Pd spores’ ability to germinate. In fact, these variations followed a seasonal pattern consistent with the timing of bats absence (reduced germination) and presence (increased germination) and could indicate adaptations of Pd to the bats’ life-cycle. The infection of bats from environmental reservoirs hence seems to be a central aspect of White-Nose disease dynamics and Pd biology. Pds ability to remain viable for extended periods outside the host increases its risk of being anthropogenically transported and might have played a role in the emergence of White-Nose disease in North America. The existence of a second species (Pd-2) poses a great additional danger to North American bats considering that its introduction there could lead to deaths and associated population declines in so-far unaffected species given what is known about differing host species preferences in Eurasian bats. Even within the native range of Pd, the movement of Pd between differentiated fungal populations could facilitate genetic exchanges (e.g., through sexual reproduction) between genetically distant genotypes. Such genetic exchanges could lead to phenotypic jumps in pathogenicity or host-species preferences and should hence be prevented. The native range of a pathogen holds great potential to better understand the genetic and ecological basis of a (wildlife) disease. My work informs about the dangers associated with the accidental transport of Pd (and other pathogens) and highlights the need for ‘prezootic’ biosecurity-oriented strategies to prevent disease outbreaks globally. Once a pathogen has arrived in a new geographic range, and particularly if it has environmentally durable spores (as demonstrated for Pd), it will be difficult/impossible to eradicate. Furthermore, a pathogen’s ability to remain viable outside the host and infect them from environmental reservoirs has been associated with an increased risk of species extinctions and needs to be considered when designing management strategies to mitigate disease impact.
• Neu auftretende Infektionskrankheiten gehören zu den größten Bedrohungen für die Gesundheit von Menschen, Tieren und Pflanzen sowie für die weltweite Artenvielfalt. Oft liegt ihnen der anthropogene Transport eines Krankheitserregers in neue geografische Verbreitungsgebiete zugrunde, wo aufgrund fehlender historischer Wirt-Pathogen Koevolution eine schlechte Anpassung des Wirtes vorliegt. Einer dieser Erreger ist der Pilz Pseudogymnoascus destructans (Pd), welcher bei überwinternden Fledermäusen die Weißnasenkrankheit (engl. White-Nose disease) verursacht. Pd wurde erstmals in Nordamerika entdeckt, wo er durch das mit ihm assoziierte Massensterben einiger nordamerikanischer Fledermausarten auffällig wurde. Erst später stellte man fest, dass Pd aus Eurasien stammt, wo der Pilz zwar weit verbreitet ist aber nicht mit einem vergleichbaren Fledermaussterben in Verbindung steht. Der Großteil der bisherigen Forschung zur Weißnasenkrankheit konzentrierte sich auf das invasive nordamerikanische Verbreitungsgebiet, wo die genetische Diversität des Erregers, und deren Rolle in der Krankheitsdynamik, vermutlich unterschätzt wurde. In meiner Arbeit untersuchte ich daher zunächst die genetische Struktur von Pd in seinem natürlichen Verbreitungsgebiet. Mithilfe einer umfangreichen Referenzsammlung von mehr als 5.000 Pd-Isolaten aus 27 Ländern konnte ich anhand verschiedener genetischer Maße (Multilokus-Genotypen, Long-Read-Sequenzierung des gesamten Genoms und Illumina NovaSeq an Isolatpools) eine starke Differenzierung zwischen zwei monophyletischen Kladen nachweisen. Diese Ergebnisse weisen auf das Vorhandensein zweier kryptischer Arten hin, beide von ihnen Erreger der Weißnasenkrankheit („Pd-1“, welcher P. destructans sensu stricto entspricht, und „Pd-2“). Beide Arten kommen im gleichen geografischen Gebiet und sogar in denselben Winterquartieren (d. h. in Sympatrie) vor – allerdings mit Art-spezifischen Wirtspräferenzen. Eine feinmaschigere Untersuchung der eurasischen Populationsstruktur zeigte eine hohe Diversität an Genotypen (innerhalb jeder Art) und größtenteils genotypische Individualität jedes Winterquartiers, wobei der Großteil der Genotypen nur jeweils in einem Quartier zu finden war (mehr als 95 % der Genotypen). Die damit verbundenen lokalen Variationen in den Allelfrequenzen der Mikrosatellitenmarkern konnten angewandt werden, um die nordamerikanischen Isolate (die ausschließlich zu Pd-1 gehören) einer Region in der Ukraine (Podilia) zuzuordnen, welche somit der wahrscheinlichste Ursprung der nordamerikanischen Einschleppung ist. Um nähere Einblicke in die räumliche und zeitliche Dynamik der Weißnasenkrankheit auf lokaler Ebene zu gewinnen, wurden mehrere Winterquartiere mit hoher Intensität beprobt (künstliches Quartier in Deutschland und natürliche Karsthöhlen in Bulgarien). Selbst zwischen nahe-gelegenen Quartieren wurde nur sehr geringer Genfluss (Austausch von Genotypen) beobachtet. Dies deutet darauf hin, dass Fledermäuse außerhalb der Überwinterungszeit kein lebensfähiges Pd tragen, ansonsten würde es zwischen Fledermäusen und Winterquartieren ausgetauscht werden und in einer homogenen Verteilung von Genotypen resultieren. Um das jährliche Auftreten der Weißnasenkrankheit zu erklären, müssen sich Fledermäuse also nach dem Sommer neu infizieren. Die Verteilung und Anzahl von Pd Genotypen auf Fledermäusen und den Wänden von Winterquartieren deuten darauf hin, dass sich Fledermäuse aus der Umwelt, und zwar von den Wänden, anstecken. Das bedeutet, dass Pd den Sommer in einem Umweltreservoir in den Winterquartieren überlebt, welches die jährlich wiederkehrenden Neuinfektionen von überwinternden Fledermäusen verursacht. Die Langlebigkeit der Pd-Sporen wurde zudem mithilfe eines experimentellen Versuchsaufbaus untersucht, welcher zeigte, dass die Sporen von Pd mindestens 2 Jahre lang auf abiotischem Substrat überleben. Darüber hinaus zeigten sich im Laufe des Experiments Schwankungen in der Keimungsfähigkeit von Sporen, welche mit der zeitlichen Dauer von Fledermaus-Abwesenheit (verringertes Wachstum) und -Anwesenheit (erhöhtes Wachstum) verknüpft zu sein schienen. Dies könnte eine Anpassung von Pd an den Lebenszyklus von Fledermäusen darstellen und deutet darauf hin, dass die Infektion von Fledermäusen aus dem Reservoir (von den Wänden) einen zentralen Aspekt der Krankheitsdynamik und der Biologie von Pd darstellt. Die Fähigkeit von Pd, über längere Zeiträume außerhalb seines Wirts lebensfähig zu bleiben, erhöht das Risiko einer anthropogenen Verschleppung und könnte beim Auftreten der Weißnasenkrankheit in Nordamerika eine Rolle gespielt haben. Das Vorhandensein einer zweiten Art (Pd-2) stellt eine große zusätzliche Gefahr für nordamerikanische Fledermäuse dar, da ihre Einschleppung zu Todesfällen und damit verbundenen Populationsrückgängen bei bisher nicht betroffenen Arten führen könnte (Im Hinblick auf die Wirtspräferenzen von Pd-1 und Pd-2 in Eurasien). Selbst anthropogene Bewegungen von Pd (intraspezifisch in Pd-1 oder Pd-2) zwischen differenzierten Populationen innerhalb des natürlichen Verbreitungsgebietes sind zu vermeiden, da sie zu genetischem Austausch (z. B. durch sexuelle Reproduktion) mit resultierenden phänotypischen Veränderungen im Hinblick auf Pathogenität oder infizierten Wirtsarten führen könnten. Das natürliche Verbreitungsgebiet eines Krankheitserregers birgt großes Potenzial, um ein besseres Verständnis der genetischen und ökologischen Basis einer (Wildtier-) Krankheit zu erhalten. Meine Arbeit informiert über die Gefahren, die mit dem unbeabsichtigten Transport von Pd (und anderen Pathogenen) einhergehen und verdeutlicht, dass "präzootische", auf Biosicherheit ausgerichtete Strategien erforderlich sind, um Krankheitsausbrüche weltweit zu verhindern. Wenn ein Erreger erst einmal in einem neuen geografischen Gebiet angekommen ist, und vor allem, wenn er über umweltbeständige Sporen verfügt (wie für Pd gezeigt), wird es schwierig bis unmöglich sein, ihn auszurotten. Die Fähigkeit eines Erregers, Wirte aus Umweltreservoiren zu infizieren wird zudem mit einem erhöhten Risiko des Artensterbens in Verbindung gebracht und muss bei der Entwicklung von Managementstrategien von Krankheiten berücksichtigt werden.