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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002424-6

Identifizierung von Virulenzfaktoren aviärer und porziner Influenzaviren mittels reverser Genetik in relevanten Tiermodellen

  • Die reverse Genetik ist ein wichtiges Werkzeug in der Grundlagenforschung und Impfstoffentwicklung der Influenza-A- und -B-Viren. Oft ist der limitierende Schritt für die Erstellung eines solchen Systems der reversen Genetik, bestehend aus mehreren Plasmiden für die einzelnen Gensegmente, die Klonierung der Virusgene in den Expressionsvektor. Für eine schnellere und einfachere Klonierung wurde in dieser Arbeit das LacZa-Fragment mittels modifizierter QuikChange-Reaktion in den Klonierungsvektor pHWSccdB inseriert. Mit dem so entstandenen Vektor pHWSccdBLacZa ist es nun möglich, zusätzlich eine Blau/Weiß-Selektion durchzuführen. Beider target-primed plasmid amplification zur Insertion des viralen Gensegmentes werden hierbei die beiden Selektionsmarker ccdB und LacZa durch das virale Gen ersetzt. Bakterienkolonien mit kloniertem Gensegment können von denen ohne komplettes Insert nun leichter und frühzeitiger durch eine nicht vorhandene Blaufärbung unterschieden werden. Schweine spielen in der Influenzavirus-Transmission eine besondere Rolle, da sie als sog. „mixing vessel“ gelten. Sie können z. B. Reassortanten aus aviären und porzinen Influenzaviren auf den Menschen übertragen, die sich bei einer zeitgleichen Infektion mit beiden Viren im Schwein bilden können. In dieser Arbeit wurden die seit 1979 in Europa zirkulierenden aviären H1N1- Schweineviren betrachtet. Sie sind Schweinestämme, deren Gene von einem aviären Vorläufervirus abstammen. Unter dem Ziel der Untersuchung der molekularen Determinanten des Wirts-Tropismus dieser aviären H1N1-Schweineviren wurden Reassortanten und Zufallsressortanten hergestellt unter Verwendung des aviären Virus A/Duck/Bavaria/1/77 (H1N1) (DkBav) und des aviären Schweinevirus A/Swine/Belgium/1/79 (H1N1) (SwBelg). Zunächst wurde die Replikationseffizienz von DkBav, SwBelg und den hergestellten Reassortanten auf einer aviären und einer porzinen Zelllinie untersucht. Hierbei wurde festgestellt, dass für das aviäre Virus DkBav das HA von SwBelg ausreicht, um in porzinen Zellen das Wachstumsniveau von SwBelg zu erreichen. Das HA-Segment ist also entscheidend für den Wirtstropismus von DkBav in einer porzinen Zelllinie. Experimente im Schwein zeigten jedoch, dass DkBav nicht alleine durch das HA von SwBelg zu einem Schweinevirus wird. Für diese Experimente wurden Schweine intranasal mit den hergestellten Viren, SwBelg und DkBav infiziert. Um die Replikation im Schwein zu steigern, benötigt DkBav zusätzlich zum HA noch das NA von SwBelg und für die Transmission von Schwein zu Schwein das NP sowie eines oder mehrere der anderen Gensegmente von SwBelg. Für eine starke Virusvermehrung in der Lunge benötigt DkBav den Polymerasekomplex, HA und NA von SwBelg. Für die Transformation in ein Schweinevirus benötigt DkBav also kein bestimmtes Gensegment, sondern eine Kombination mehrerer Gensegmente. Für hochpathogene aviäre Influenzaviren ist die polybasische Spaltstelle des Oberflächenproteins HA der wichtigste Virulenzfaktor. Das HA ist u. a. für die Bindung und die Fusion der Endosomenmembran von Influenzaviren mit der Wirtszelle zuständig. Da eine polybasische HA-Spaltstelle alleine jedoch nicht ausreicht, um die Virulenz eines LPAIV deutlich zu erhöhen, wurde in dieser Arbeit nach weiteren Virulenzdeterminanten im HA des hochpathogenen Influenzavirus A/Swan/Germany/R65/2006 (H5N1) (R65wt) zusätzlich zur polybasischen Spaltstelle gesucht. Hierzu wurden von den Viren R65wt und A/Teal/Germany/Wv632/2005 (H5N1) mit eingesetzter polybasischer Spaltstelle (TG05poly) verschiedene HA-Chimären und -Mutanten hergestellt und diese in vitro und in vivo untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass die eingefügten Mutationen nicht ausreichten, um TG05poly zu einem hochpathogenen Virus zu machen. Für das hochpathogene Virus R65wt wurden die Aminosäuren HA-R123 und HAI124 als weitere Virulenzdeterminanten identifiziert. Bei HA-Sequenz- und HAStrukturanalysen wurde festgestellt, dass die Aminosäuren HA-123 und HA-124 innerhalb des niedrigpathogenen bzw. des hochpathogenen Phänotyps hoch konserviert vorliegen. Mutationen an diesen Positionen verringern nicht nur HA-Aktivierungs-pH und Virus-Inaktivierungs-pH deutlich, sondern auch die Letalität des Virus um fast 50 % (HA-I124T) oder das Virus wurde sogar avirulent (HA-R123S). Im Falle einer polybasischen Spaltstelle ist also eine erhöhte pH-Stabilität des HA vermittelt durch die Aminosäure R123 essentiell für die Entstehung eines hochpathogenen aviären H5N1-Virus aus einem niedrigpathogenen Vorläufer.
  • Reverse genetics has become crucial for basic research and vaccine development of influenza A and B viruses. The limiting work step for construction of a reverse genetic system, composed of several plasmids for the individual gene segments, is however, in the majority of cases, cloning of the virus genes into expression vector. For a universal and simple method of cloning, the LacZa fragment was inserted into the cloning vector pHWSccdB by a modificated QuikChange reaction. With the constructed cloning vector pHWSccdB-LacZa now an additional blue/white-screening is possible. During the target-primed plasmid amplification, both selection markers ccdB and LacZa are replaced by the viral gene. Bacteria colonies with an inserted gene segment can be discriminated more simple and rapidly from those without a complete insert by a non-existent blue staining. Pigs are considered to play a particular role in influenza virus transmission, because they might function as „mixing vessel“. They may transmit reassortants of avian and porcine influenza viruses to humans. Those reassortants arise from simultaneous infection of the pig with both viruses. In this work, avian-like H1N1 swine influenza virus, which has been circulating since 1979 in Europe, were used. They are swine strains whose genes descended from an avian precursor virus. To analyze the molecular determinants of host tropism of avian-like H1N1 swine viruses, reassortants and mixed reassortants were generated using the avian virus A/Duck/Bavaria/1/77 (H1N1) (DkBav) and avian-like swine virus A/Swine/Belgium/1/79 (H1N1) (SwBelg). First, replication efficiency of DkBav, SwBelg, and of the reassortants in avian and porcine cells was analyzed. Remarkably the virus DkBav results in growth levels of SwBelg in porcine cells. Therefore the HA segment is important for host tropism of DkBav in porcine cells. However, animal experiments in pigs demonstrated, that DkBav needs more than HA of SwBelg to become a swine virus. For those experiments, pigs were infected intranasal with the constructed reassortants, SwBelg, or DkBav. To increase replication in pigs, DkBav depends on HA and NA of SwBelg, for pig-to-pig transmission on NP and one or more of the other gene segments of SwBelg. Moreover, for virus propagation in lung, DkBav needs the polymerase complex, HA, and NA of SwBelg. For transformation into a swine virus, DkBav requires no special gene segment but a combination of several gene segments. The polybasic cleavage site of the surface protein HA is the major virulence factor of high-pathogenic avian influenza viruses. The HA is responsible for binding and fusion of influenza viruses with host cells. Since the artificial introduction of a polybasic cleavage site does not necessarily increase the virulence of a LPAIV significantly, additional virulence determinants in HA of high pathogenic A/Swan/Germany/R65/2006 (H5N1) (R65wt) should be found. To this end, different HA chimeras and mutants of the viruses R65wt and A/Teal/Germany/Wv632/2005 (H5N1) with polybasic cleavage site (TG05poly) were constructed and in vitro and in vivo analysis performed. The introduced mutations were not sufficient to change TG05poly to a high-pathogenic virus. Moreover, the amino acids at residues HA-123 and HA-124 were identified as additional virulence determinants in the high pathogenic virus R65wt. HA sequence and HA structure analysis revealed, that the amino acids HA-123 and HA-124 are highly conserved among the low-pathogenic respectively the high-pathogenic strains. Mutations at these positions decreased not only HA activation pH and virus inactivation pH, but also the lethality of the virus about nearly 50 % (HA-I124T) or the virus became avirulent (HA-R123S). However, in case of a polybasic cleavage site, an increased pH stability of HA mediated by amino acid R123 is essential for the evolution of a high pathogenic avian H5N1 virus from a low pathogenic precursor.

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Metadaten
Author: Ute Wessels
URN:urn:nbn:de:gbv:9-002424-6
Title Additional (English):Identification of Virulence Determinants of Avian and Porcine Influenza Viruses by Reverse Genetics in Relevant Animal Hosts
Advisor:Dr. Jürgen Stech, Prof. Dr. Dr. h.c. Thomas C. Mettenleiter
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2016/02/03
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2016/01/29
Release Date:2016/02/03
Tag:Blau/Weiß-Selektion, Hämagglutinin, aviäre Schweineviren
GND Keyword:A/H5N1 Influenza, Aviäre Influenza, Geflügelpest, Pathogenität, Vogelgrippe
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Abteilung für Mikrobiologie und Molekularbiologie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie