Open Access

Friedrich Kapp

• Gegenstand der Arbeit ist, die in Vorversuchen mittels Microarray - Analyse in Lungenkarzinomen identifizierte, hochregulierte 5-α-Reduktase Typ I (SRD5A1) als einen möglichen Therapieansatzpunkt zu evaluieren. Hierfür wurde ein Knockdown mittels siRNA etabliert, bevor Proliferationsversuche, Zellzyklus - Analysen und Apoptose- /Nekrose- Assays in zwei aus Lungentumoren stammenden Zelllinien (A549 und NCI-H460) durchgeführt wurden. Der Knockdown zeigte auf mRNA - Ebene sehr gute Ergebnisse. Im Western Blot gelang die Darstellung der SRD5A1 nicht durch direkte Antikörper, es konnte jedoch mittels Überexpression und nachfolgender RNAi in der Darstellung mittels V5 - Antikörpern sowohl ein guter Knockdown gezeigt werden, als auch eine ausreichend kurze Halbwertszeit der 5-α-Reduktase angenommen werden. In den ersten Proliferationsversuchen mit 5 μl Lipofectamine zeigten sich Wachstumsverlangsamungen sowohl in allen mit RNA behandelten Gruppen als auch in der Lipofectamine - Gruppe. Ein Unterschied in der Proliferation zwischen den mit zielgerichteter siRNA (siRNA 1 - 3) und den mit mismatch siRNA (mm 1 - 3) behandelten Gruppen war nicht festzustellen. Daraufhin wurde erneut der Knockdown etabliert, nun mit auf 2,5 μl reduziertes Lipofectamine. Bei nun nicht mehr durch Lipofectamine kompromittierter Proliferation war eine unterschiedliche Proliferation in den siRNA - Gruppen gegenüber den mm - Gruppen nicht festzustellen. Auch in der Zellzyklus - Analyse und dem Apoptose- / Nekrose- Assay ergaben sich keine Hinweise auf Unterschiede zwischen siRNA- behandelten Gruppen und mm- behandelten Gruppen. Zusätzlich zu diesen Knockdown - Versuchen sollten drei bereits vorliegende SRD5A1 - Inhibitoren auf ihre wachstumshemmende Kapazität geprüft werden. Auch in diesen Versuchen konnte kein proliferationshemmender Einfluß durch die Inaktivierung der SRD5A1 nachgewiesen werden. Es kann nach Prüfung sowohl durch RNA - Interferenz als auch durch direkte Hemmung der SRD5A1 festgestellt werden, dass die 5-α-Reduktase Typ I nicht ausschlaggebend zur Proliferation von NSCLC beiträgt und insofern kein Therapieziel für diese Art von Tumoren darstellt.
• Background: Non-small cell lung cancer (NSCLC) is one of the most frequent malignancies and has a high mortality rate due to late detection and lack of efficient treatments. Identifying novel drug targets for this indication may open the way for new treatment strategies. Comparison of gene expression profiles of NSCLC and normal adjacent tissue (NAT) allowed the identification of 5-α-reductase type I (SRD5A1) which was up-regulated in NSCLC compared to NAT. This raised the question whether SRD5A1 was an important enzyme relevant for sustained proliferation of NSCLC. Methods: siRNA-mediated knock-down of SRD5A1 was performed in A549 and NCI-H460 lung cancer cell lines in order to determine the effects on proliferation, cell distribution during the different phases of the cell cycle, and on apoptosis and necrosis. In addition, lung cancer cell lines were treated with 4-aza-steroids, which specifically inhibit SRD5A1 activity, and effects on proliferation were measured. Statistical analyses using ANOVA and post-hoc Tamhane-T2-test were performed. In the case of non-parametric data, the Kruskall-Wallis test and the post-hoc Mann-Whitney-U-test were used. Results: The knock-down of SRDA51 expression was very efficient with the SRD5A1 transcripts being reduced to less than 10% of control levels. Knock-down efficiency was furthermore confirmed at the protein level. However, no effect of SRD5A1 knock-down was observed in the proliferation assay, the cell cycle analysis, and the apoptosis/necrosis assay. Treatment of lung cancer cell lines with 4-aza-steroids did not inhibit proliferation. Conclusions: In summary, the results suggest that SRD5A1 is not a crucial enzyme for the sustained proliferation of NSCLC cell lines.