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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-001098-4

Bedeutung des essentiellen Tegumentproteins pUL36 des Pseudorabies Virus für den Virus-Eintritt und die Morphogenese

  • Das 3084 Aminosäuren umfassende innere Tegumentprotein pUL36 des zu den Herpesviren zählenden Pseudorabies Virus (PrV) stellt ein multifunktionelles Protein dar, das für die sekundäre Umhüllung der Nukleokapside im Zytoplasma essentiell ist. Darüber hinaus spielt es eine wichtige Rolle bei der frühen Phase der Replikation, d.h. dem Transport der Nukleokapside zum Zellkern und der Andockung an die Kernpore als Voraussetzung für die Freisetzung der viralen DNA in den Zellkern. Um die Rolle von PrV pUL36 während des viralen Replikationszyklus weiter aufzuklären, wurden funktionelle Regionen identifiziert und bekannte Motive und Regionen mittels gezielter Deletion bzw. Mutagenese untersucht. Zunächst wurden eine konservierte Deubiquitinylierungs (DUB)-Domäne und potentielle Leucin-Zipper-Motive im N-Terminus des Proteins, sowie eine Alanin- und Prolin-reiche Region im C-Terminus mittels gezielter Deletionen untersucht. Zusätzlich wurden durch ungerichtete Transposon-vermittelte Mutagenese Insertionsmutanten hergestellt. Die Funktionalität dieser Mutanten wurde durch Komplementierung einer UL36-negativen PrV Mutante untersucht. Mutierte Proteine, in denen essentielle Regionen betroffen waren, konnten den Replikationsdefekt der Virusmutante nicht kompensieren, während für Mutanten, die den Defekt komplementieren konnten, stabile Virusrekombinanten isoliert wurden. Die phänotypische Charakterisierung der Mutanten erfolgte mittels Plaquegrößenvergleich, Ein-Schritt-Wachstumskinetik und Ultrastrukturanalyse. Zusätzlich wurden einige Mutanten hinsichtlich des Replikationsverhaltens in vivo in einem Mausmodell untersucht. Um die Funktion von PrV pUL36 aufzuklären, ist es notwendig die intrazelluläre Lokalisierung von pUL36 zu kennen. Dazu wurden Immunfluoreszenz- und Ultrastrukturanalysen mit vier gegen unterschiedliche Bereiche des pUL36 gerichteten Antiseren durchgeführt. Auch die potentiellen Kernlokalisierungssignale (NLS) wurden hinsichtlich ihrer Funktion untersucht und die N-terminalen NLS-Motive 1/2 deletiert. Trotz der Funktionalität der essentiellen N-terminalen NLS-Motive 1/2 (Abb. 11) wurde pUL36 während der Virusreplikation niemals im Zellkern nachgewiesen, was darauf hindeutet, dass die Tegumentierung ausschließlich im Zytoplasma abläuft. Die NLS vermitteln also bei der Infektion keinen Kerntransport des pUL36. Die Bedeutung der NLS könnte aber mit dem Transport der Kapside entlang der Mikrotubuli zum Zellkern und dem Andocken an die Kernporen zusammenhängen. Im Gegensatz dazu spielen die Leucin-Zipper (Abb. 11) offenbar bei der sekundären Umhüllung eine Rolle. Sie sind möglicherweise an der Verbindung des inneren und äußeren Teguments beteiligt. Im N-Terminus von pUL36 konnte zwischen der Interaktionsdomäne mit dem Komplexpartner pUL37 und den Leucin-Zippern eine weitere wichtige Region (Abb. 11) identifiziert werden. Diese Region ist auch in die sekundäre Umhüllung im Zytoplasma involviert und könnte für den Transport der teilweise tegumentierten Nukleokapside zum Trans-Golgi-Netzwerk verantwortlich sein, wobei pUL36, nicht aber die pUL36-pUL37-Interaktion hierbei eine Rolle spielt. Die gleichzeitige Deletion der DUB-Domäne und der Alanin- und Prolin-reichen Region (Abb. 11) führte zu einem Defekt bei der sekundären Umhüllung, wohingegen die Alanin- und Prolin-reiche Region allein für die Replikation von PrV kaum eine Rolle spielt. Allerdings konnte die Deletion nicht ohne Funktionsverlust weiter vergrößert werden, so dass die angrenzenden Bereiche für die Funktion von pUL36 essentiell sein könnten. Die zentrale Region von Aminosäure 1540 bis 1987 (Abb. 11) grenzt an diese Alanin- und Prolin-reiche Region an und ist für die Funktion von pUL36 essentiell, was durch den Funktionsverlust nach Insertionsmutagenese (mit einer Ausnahme) in diesem Bereich demonstriert wurde. Demnach könnte diese Region eine Rolle während der frühen Phase der Infektion, wie z.B. beim Transport der Kapside zum Zellkern und/oder beim Andocken der Kapside an die Kernpore und der Freilassung der DNA in den Zellkern spielen. Der essentielle C-Terminus von pUL36 (Abb. 11) kann wahrscheinlich auf die Aminosäuren 3022 bis 3066 eingegrenzt werden, so dass nicht nur die letzten 6, sondern womöglich die endständigen 18 Aminosäuren für die Funktion von pUL36 nicht gebraucht werden.
  • The 3084 aa large inner tegument protein pUL36 of the herpesvirus Pseudorabies Virus (PrV) is a multifunctional protein which is essential for secondary envelopment of the nucleocapsids in the cytoplasm. Besides this function late in infection, pUL36 also plays an important role during early stages of replication, i.e. transport of nucleocapsids to the nucleus and docking at the nuclear pore prior to release of the viral genomic DNA into the nucleus. To clarify the multifunctional role of PrV pUL36 during replication, further functional regions were identified and known domains and motifs were analyzed using directed deletion and random insertion mutagenesis. First, a conserved deubiquitination (DUB)-domain and potential leucine-zipper motifs within the N-terminus as well as an alanine- and proline-rich region within the C-terminus were deleted. Insertion mutants were constructed using random transposon-mediated mutagenesis. The functionality of the mutants was tested in transient complementation assays of a UL36-deleted PrV mutant. Loss of function mutations in essential regions abolished transcomplementation, whereas for functional mutants stable virus recombinants were isolated for further analysis. Mutants were phenotypically characterized by plaque size comparisons, one-step growth kinetics and ultrastructural analyses. Additional, several mutants were investigated with regard to the replication properties using a murine infection model. To clarify the function of PrV pUL36 during secondary envelopment, the intracellular localization of pUL36 was analyzed. To this end, immunofluorescence and ultrastructural analyses were performed with four pUL36 antisera directed against different parts of the protein. Furthermore, potential nuclear localization signals (NLS) were tested with respect to their functionality and the N-terminal NLS motifs 1/2 were deleted. Despite the functionality of the essential N-terminal NLS-motifs 1/2 (Fig. 11) pUL36 was never detected in the nucleus during virus replication indicating that tegumentation occurs solely in the cytoplasm. Thus, the NLS motifs do not mediate nuclear import of pUL36 during infection. The importance of the NLS could, however, be associated with the transport of incoming nucleocapsids along microtubule to the nucleus and docking at the nuclear pore. In contrast, the leucine zippers (Fig. 11) apparently play an important role during secondary envelopment and could be engaged in linking inner and outer tegument. In the N-terminus of pUL36 a relevant region located between the interaction domain with the pUL37 complex partner and the leucine zippers could be identified (Fig. 11). This region is also involved in the secondary envelopment into the cytoplasm und could be involved in transport of partially tegumented nucleocapsids to the trans-Golgi-network, which requires pUL36 but not necessarily the pUL36-pUL37-interaction. Simultaneous deletion of the DUB-domain and the alanine- and proline-rich region (Fig. 11) results in a defect during secondary envelopment into the cytoplasm. The alanine- and proline-rich region alone is not important for the replication of PrV. However, any enlargement of the engineered deletion to either the C- or N-terminus results in a non-functional protein indicating that the bordering regions are essential for the pUL36 function. The central region of PrV pUL36 between amino acids 1540 to 1987 (Fig. 11) borders on this alanine- and proline-rich region and is essential for the virus replication into the cell culture as shown by clustering of insertions (only one exception) resulting in a non-functional protein. Thus, this region could play a crucial role during secondary envelopment, for capsid transport to the nucleus and/or for docking of the capsids at the nuclear pore and the release of the viral DNA into the nucleus. The essential C-terminus of pUL36 may presumably be delineated to amino acids 3022 to 3066 indicating that not only the penultimate 6 amino acids but the last 18 amino acids are nonessential for pUL36 function.

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Metadaten
Author: Britta Sydne Möhl
URN:urn:nbn:de:gbv:9-001098-4
Title Additional (English):Functional Role of the large tegument protein pUL36 of Pseudorabies Virus in virus entry and virion maturation
Advisor:Prof. Dr. Dr. h.c. Thomas C. Mettenleiter
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2011/11/03
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2011/10/28
Release Date:2011/11/03
Tag:Morphogenese, Virus-Eintritt, essentielles Tegumentprotein pUL36
large tegument protein pUL36, virion morphogenesis, virus entry
GND Keyword:Herpesvirus suis
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Abteilung für Mikrobiologie und Molekularbiologie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie