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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002358-2

Generierung und Evaluierung rekombinanter Pseudorabies Virus basierter Vektor-Vakzine zur Immunisierung von Schweinen gegen das pandemische H1N1 Influenzavirus von 2009

  • Influenzaviren zählen zu den gefährlichsten Infektionserregern, die im Menschen weltweit schwere respiratorische Erkrankungen auslösen. Von großer Relevanz sind allerdings auch Reservoirwirte, in denen die Infektionen häufig mild verlaufen, aber durch Mutationen und Reassortierung einzelner Genomsegmente neue, potentiell auch humanpathogene Influenzaviren entstehen können. Die im Jahre 2009 aufgetretene humane Influenzapandemie, welche durch ein H1N1 „swine origin“ Influenza A Virus (SoIV) ausgelöst wurde, verdeutlichte die besondere Bedeutung porziner Reservoirwirte. Da Schweine sowohl für aviäre als auch humane Influenza A Viren empfänglich sind, wird ihnen eine wichtige Rolle als „mixing vessel“ für die Entstehung neuer Influenzaviren zugeschrieben. Aufgrund vielversprechender Entwicklungen auf dem Gebiet der Lebendvirus-Vektor-Vakzine war es das Ziel dieser Arbeit, einen neuartigen Vektor-Impfstoff für Schweine gegen das pandemische H1N1 SoIV auf der Basis eines attenuierten porzinen Virus zu generieren. Da das Pseudorabies Virus (PrV) nicht humanpathogen ist und in seinem natürlichen Wirt, dem Schwein, hervorragend repliziert, eignete es sich besonders für die Entwicklung eines rekombinanten Vektor-Impfstoffs. Hierzu wurde der bewährte Impfstamm PrV-Bartha genetisch so verändert, dass anstelle des nicht essentiellen herpesviralen Glycoproteins gG immunogene Influenzavirusproteine wie die Hüll-Glykoproteine Hämagglutinin (HA) und Neuraminidase (NA), aber auch das Nukleoprotein (NP) und die Matrixproteine (M1 und M2) des pandemischen H1N1 SoIV exprimiert werden. Die Expression erfolgte unter der Kontrolle des humanen oder murinen Cytomegalievirus immediate-early Promotors, wobei sich letzterer als stärker erwies. Durch Insertion eines synthetischen Introns in der 5´-nicht-translatierten Region konnte die Expression der Transgene weiter gesteigert werden. Zu einer substantiellen Verbesserung der Expression führte die Insertion synthetischer HA- (synH1) und NA-Gene (synN1), deren Sequenzen an die Codon-Präferenzen von PrV angepasst waren. In tierexperimentellen Studien wurde gezeigt, dass sowohl die optimierte HA- (PrV-BaMI-synHI), als auch die optimierte NA-exprimirende PrV-Rekombinante (PrV-BaMI-synN1) nach intramuskulärer prime-boost Vakzinierung sieben Wochen alter Saugferkel deutlich höhere Antigen-spezifische Antikörpertiter induzierte als eine intranasale Infektion mit H1N1 SoIV. Auch die ein- bzw. zweimalige intranasale Impfung mit PrV-BaMI-synH1 führte in allen Tieren zur Bildung HA-spezifischer Serumantikörper, allerdings in deutlich geringen Mengen. In allen Fällen führte die 3 Wochen nach Erstimmunisierung durchgeführte Auffrischungsimpfung zu einem beträchtlichen Anstieg der HA- bzw. NA-spezifischen Antikörpertiter. In durchflusszytometrischen Analysen peripherer Blutlymphozyten konnte ebenfalls eine vermehrte Aktivierung und Proliferation von B-Zellen zu Antikörper-produzierenden Plasmazellen nach der Auffrischungsimpfung beobachtet werden. Außerdem wurde festgestellt, dass die durch PrV-BaMI-synN1 induzierte NA-spezifische Immunantwort deutlich später einsetzte als die durch PrV-BaMI-synH1 vermittelte HA-spezifische Reaktion. Versuchstiere, die gleichzeitig mit PrV-BaMI-synH1 und PrV-BaMI-synN1 geimpft wurden, entwickelten sowohl HA- als auch NA-spezifische Antikörper zu vergleichbaren Titern wie mit den einzelnen Viren immunisierte Tiere. Drei Wochen nach der letzten Immunisierung wurden alle mit PrV-BaMI-synH1 und/oder PrV-BaMI-synN1 geimpften Schweine sowie mit dem leeren Vektor PrV-Bartha vakzinierte und naive Kontrolltiere einer Belastungsinfektion mit dem pandemischen H1N1 SoIV A/California/7/09 unterzogen. Beide potentiellen Vektor-Impfstoffe verhinderten die Ausbildung klinische Symptome und hemmten die Replikation und Ausscheidung des Belastungsvirus signifikant, wie real-time RT-PCR Analysen von Nasentupferproben zeigten. Allerdings war die durch intramuskuläre prime-boost Vakzinierung mit PrV-BaMI-synN1 bewirkte Reduktion der Viruslast deutlich geringer als die mit PrV-BaMI-synH1. Die kombinierte intramuskuläre Applikation beider Vektor-Vakzine zeigte keine additiven Effekte, sondern eine ähnliche Schutzwirkung wie PrV-BaMI-synH1 allein. Während die zweimalige intramuskuläre Immunisierung mit PrV-BaMI-synH1 oder beiden Viren die Übertragung des Belastungsvirus auf naive Kontakttiere zwar erheblich verzögerte, aber nicht verhinderte, wurde dieses Ziel durch eine zweimalige intranasale Immunisierung mit PrV-BaMI-synH1 erreicht. Die RNA-Analysen der Tupferproben zeigten dabei eine fast vollständige Inhibition der Belastungsvirusreplikation, obwohl die HA-spezifischen Antikörper in diesen Tieren weitaus geringer waren als in intramuskulär geimpften Versuchstieren. Auch im Vergleich zu einer einmaligen intranasalen Vakzinierung reduzierte die intranasale Auffrischungsimpfung mit PrV-BaMI-synH1 die Replikationsdauer und die nachweisbaren Mengen des H1N1 SoIV erheblich.
  • Influenza viruses are among the most important infectious agents causing severe respiratory diseases in humans worldwide. So called reservoir hosts, in which new influenza viruses arise by mutation or reassortment of single genome segments, constitute a major risk factor not only for animal husbandry but also for global health due to possible formation of new human pathogenic viruses. This was illustrated by the human influenza pandemic in 2009 caused by H1N1 swine origin influenza virus (SoIV), where pigs were identified as reservoir host for the emerging virus strain. Since pigs are susceptible for both, avian and mammalian influenza A viruses, they can function as mixing vessels for the generation of new pathogens by reassortment of genome segments from different viruses. Due to recent developments in the field of live virus vector vaccines it was the goal in this study to generate a new vector vaccine for pigs directed against the pandemic H1N1 influenza virus based on an attenuated porcine virus. For this, the herpesvirus Pseudorabies virus (PrV) was utilized as the vector since it replicates well in pigs as the natural host and it is not pathogenic for humans. Therefore, the attenuated PrV vaccine strain PrV-Bartha was genetically modified in order to synthesize immunogenic influenza virus proteins instead of the nonessential glycoprotein gG. Thereby, influenza virus surface proteins hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) as well as the nucleoprotein (NP) and matrix proteins (M1 and M2) of pandemic H1N1 SoIV were primarily considered. For the generation of PrV recombinants the authentic reverse transcribed influenza virus genes were inserted into a PrV vector, while gene expression occurred under control of the human or murine cytomegalovirus immediate-early promoter. The insertion of a synthetic intron into the 5’-non-translating region substantially enhanced gene expression. Moreover, the insertion of synthetic HA- (synH1) and NA- (synN1) genes, in which codon usage was adapted to PrV, further improved gene expression. Animal experiments revealed that both, optimized HA (PrV-BaMI-synH1) and NA-expressing PrV recombinants (PrV-BaMI-synN1), induced significantly higher antigen-specific antibody titers in seven-week-old piglets when vaccinated intramuscularly by prime-boost vaccination than after intranasal infection with H1N1 SoIV. Moreover, single or double intranasal vaccination with PrV-BaMI-synH1 lead to expression of HA-specific serum antibodies although to reduced levels. In all cases prime-boost vaccination performed 3 weeks after the first immunization increased significantly HA- or NA-specific antibody titers. Flow cytometry analyses of peripheral blood lymphocytes also indicated enhanced activation and proliferation of B cells to antibody-forming plasma cells after boost vaccination. Furthermore, the humoral immune response of pigs vaccinated with PrV- BaMI-synN1 was significantly delayed compared to animals immunized with PrV-BamHI-synH1. Combined vaccination with PrV-BaMI-synH1 and PrV-BaMI-synN1 induced HA- as well as NA-specific antibodies at comparable levels like monovalent immunization with either of the two PrV recombinants. Three weeks after vaccination, all animals immunized by PrV-BaMI-synH1 and/or PrV-BaMI-synN1 as well as with empty vector PrV-Bartha and/or naïve control animals were challenged with homologous pandemic H1N1 SoIV A/California/7/09. Both potential vector vaccines impeded clinical symptoms and inhibited significantly viral replication and spread after challenge infection, as shown by real-time RT-PCR analysis of nasal swab samples. However, intramuscular prime-boost vaccination with PrV-BaMI-synN1 led to a considerably lower viral load than after immunization with PrV-BaMI-synH1. A combined immunization of both vector vaccines applied intramuscularly did not have an additive effect, but instead yielded the same protective efficacy as single immunization with PrV-BaMI-synH1. While virus transmission to naïve contact pigs was delayed but not prevented after double intramuscular immunization with PrV-BaMI-synH1 or both vector vaccines, transmission was impeded after double intranasal immunization with PrV-BaMI-synH1. Thereby, the analysis of nasal swabs revealed that replication of challenge was virus was almost completely inhibited, although titers of HA-specific serum antibodies were significantly lower than in animals immunized intramuscularly with the same vaccine. Compared to single intranasal immunization the detectable amounts of H1N1 SoIV were substantially reduced after intranasal prime-boost vaccination with PrV-BaMI-synH1.

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Metadaten
Author: Katharina Paßvogel
URN:urn:nbn:de:gbv:9-002358-2
Title Additional (English):Generation and evaluation of recombinant pseudorabies virus based vector vaccines for the immunization of pigs against pandemic H1N1 influenza virus of 2009
Advisor:Prof. Dr. Dr. h.c. Thomas C. Mettenleiter
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2015/11/25
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2015/11/18
Release Date:2015/11/25
Tag:Influenzavirus, Pseudorabies Virus, Vektor-Vakzine
influenza virus, pseudorabies virus, vector vaccine
GND Keyword:Influenzavirus, Pseudorabies Virus, Vektor-Vakzine
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Abteilung für Mikrobiologie und Molekularbiologie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie