Open Access

Ann-Kristin Henning

• Mit der Entwicklung von sanften Ionisierungsverfahren wie der MALDI ist es seit Ende der 1980er Jahre möglich, Proteine und Peptide effizient in die Gasphase zu überführen, zu ionisieren und einer massenspektrometrischen Untersuchung zuzuführen. Dennoch bleibt die massenspektrometrische Proteomanalyse aufgrund seiner hohen Komplexität und hohen Konzentrationsunterschiede von bis zu 10 Zehnerpotenzen eine Herausforderung. Wegen ihrer leichten Zugänglichkeit werden Körperflüssigkeiten wie Plasma und Serum in der Medizin routinemäßig für diagnostische Zwecke eingesetzt. Die Entwicklung von Biomarkern aus Plasma und Serum wird allerdings durch die extrem unterschiedlichen physiologischen Konzentrationen verschiedener Plasmaproteine sehr erschwert. Die Zusammensetzung des menschlichen Plasmas ist in zahlreichen Studien intensiv analysiert worden, wohingegen für das Rind bis auf einige 2D-elektrophoretische Kartierungen nur wenige Studien vorliegen. Das im Vergleich zu Humanproben geringere Interesse an Proben z.B. bovinen Ursprungs zeigt sich auch am Mangel spezifischer Reagenzien zu deren Analyse und führt zu einer vergleichsweise schlechten Dokumentation der Zusammensetzung boviner Plasmen. Für eine detaillierte Analyse des bovinen Plasmaproteoms wurde daher ein dreistufiger Arbeitsablauf entwickelt. In einem ersten Schritt sollte die Proteinkonzentration im Ausgangsmaterial angeglichen werden. Dazu wurden zwei Methoden miteinander verglichen. Die bei humanen Proben angewandte Standardmethode der Extraktion von Albumin mit CB-modifizierten Matrizen ergab keine zufriedenstellende Bindungsspezifizität für BSA und ist daher für das Rind und andere getestete Nutztiere nicht anwendbar. Im Gegensatz dazu führte die Egalisierung mittels CPLL zu der gewünschten Angleichung der Proteinkonzentration und zu einer deutlichen Erhöhung der Ausbeuten an identifizierten Proteinen in der MS-Analyse. Der zweite Schritt des Arbeitsablaufes dient der Reduktion der Probenkomplexität durch Fraktionierung der Proben mit den folgenden drei Verfahren: (i) die SDS-PAGE mit anschließendem In-Gel-Verdau („geLC-MS“), (ii) die gelfreie präparative isoelektrische Fokussierung („offgeLC-MS“) der Plasmaproteine oder (iii) die Fraktionierung der proteolytischen Peptide durch präparative gelfreie Fokussierung. Die dabei erhaltenen Fraktionen wurden im dritten Schritt durch nLC-MALDI-TOF/TOF MS analysiert. Alle drei Fraktionierungsstrategien führten nochmals zu einer verbesserten Ausbeute an Proteinidentifizierungen, wobei sich die gelfreie Peptidfokussierung als leistungsfähigstes Verfahren erwies. Die drei Fraktionierungsmethoden sind teilweise komplementär, da von den insgesamt 296 identifizierten Proteinen lediglich 96 in allen drei Ansätzen mittels MS nachweisbar waren. Nach einer weiteren Shotgun-Analyse mit einer anderen Protease wurde aus allen verfügbaren Daten schließlich ein Gesamtkatalog von 480 bovinen Plasmaproteinen erstellt. Während der Plasmaproteomstudie wurde auf Basis einer Zufallsbeobachtung eine alternative Methode zur Abreicherung von abundanten Serumproteinen entwickelt. Die Verdünnung oder Dialyse von Serumproben führte bei leicht sauren pH-Werten reproduzierbar zur Bildung eines Niederschlags, in dem die Konzentrationen der einzelnen Proteine ähnlich ausgeglichen schienen wie nach einer Extraktion mit CPLL. Das Präzipitat wurde mittels qualitativer und quantitativer MS näher charakterisiert. Im Vergleich mit einem parallel analysierten CPLL-behandeltem Serum wurde eine ähnlich effiziente Entfernung von BSA aufgezeigt. Die Proteinzusammensetzung beider Präparate erwies sich jedoch nach Analyse mittels 1D und 2D Gelelektrophorese und nLC-MALDI-TOF/TOF MS als signifikant unterschiedlich. Bezüglich der Abreicherung von abundanten und der Anreicherung von weniger abundanten Proteinen wiesen beide Verfahren unterschiedliche Profile auf, die nach Einführung einer Isotopenmarkierung mittels quantitativer MS charakterisiert wurden. Beide Verfahren waren exzellent reproduzierbar. Für eine eingehende Analyse des Präzipitats wurden nach erfolgtem tryptischen Verdau die Peptide durch präparative gelfreie Fokussierung fraktioniert und die Fraktionen sowohl durch nLC-MALDI-TOF/TOF MS als auch mit einem Orbitrap Massenspektrometer analysiert. Auf diese Weise konnten im Präzipitat insgesamt 306 Proteine identifiziert werden. Die GO-Analyse zeigte, dass darin typische Plasmaproteine angereichert sind. Die Methode eignet sich damit hervorragend als Ergänzung zum CPLL-Verfahren. Virusbedingte Erkrankungen von Wildtieren und Nutztieren werden zunehmend auch unter dem Aspekt der Übertragbarkeit auf den Menschen betrachtet. Zu solchen Erregern mit zoonotischem Potential gehören auch die zur Gattung Henipavirus zählenden Arten Hendravirus (HeV) und Nipahvirus (NiV). Das Matrixprotein dieser Viren ist für den vollständigen Zusammenbau des Viruspartikels und den Budding-Prozess bei der Virusfreisetzung verantwortlich und unterliegt einer nukleo-zytoplasmatische Passage. Welche Interaktionen zwischen Virus und Wirt während dieses Prozesses genau ablaufen und welche zellulären Faktoren dabei eine Rolle spielen, ist bisher nicht bekannt. Um solche Faktoren zu identifizieren wurden daher Proteinkomplexe charakterisiert, die durch Affinitätsreinigung mit Strep-markiertem HeV M isoliert wurden. Dabei wurde die Interaktion von ANP32B mit HeV M mit Hilfe der MALDI-TOF/TOF MS nachgewiesen und durch weitere Analysen bestätigt. So gelang in reziproken Co-Immunpräzipitationen die Fällung des jeweils anderen Bindungspartners und in fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen wurde gezeigt, dass M nur bei Anwesenheit des ANP32B im Zellkern akkumuliert. Dies wurde für HeV M und NiV M sowohl in transfizierten als auch in virusinfizierten Zellen nachgewiesen. Die Unterdrückung der ANP32B Expression in infizierten Zellen hatte keinen Einfluss auf den Budding-Prozess, so dass die Hypothese, die nukleo-zytoplasmatische Passage des M-Proteins sei essentiell für die Virusfreisetzung, nicht bestätigt werden konnte.
• The development of soft ionization techniques like MALDI in the late 1980s enabled the efficient ionization and transfer of proteins and peptides into the gas phase and, thus, has greatly enhanced mass spectrometric analysis of these molecules. Nevertheless, mass spectrometric proteome analysis remains a challenge because of its high complexity and its high dynamic range of protein concentrations of up to 10 orders of magnitude. Bodily fluids such as plasma or serum are easily accessible and therefore routinely used for diagnostic purposes. However, development of biomarkers is difficult due to the extreme range of protein concentrations that severely hamper plasma or serum proteome analysis. The composition of human plasma has been analyzed intensively while only few studies with 2D electrophoretic maps of a limited number of bovine plasma proteins have been published. The limited interest in samples e.g. of bovine origin in comparison to human samples also leads to lack of specific reagents for its analysis and results in a relative poor documentation of the composition of bovine plasma. To improve analysis of the bovine plasma proteome a three-step proteomic workflow was developed. In the first step, the range of protein concentration was reduced. For this purpose two standard methods were tested that are routinely applied to human serum and plasma samples, namely albumin extraction with CB-modified matrices and equalization of protein concentrations by CPLL. Binding specificity of bovine albumin to CB-modified matrices was not satisfactory for plasma of cattle and other species tested and therefore CB-treatment is not an option for the removal of BSA from bovine plasma. In contrast, the treatment with CPLL resulted in the desired equalization of the protein concentrations and significantly increased yield of proteins identified by MS analysis. In the second step of the workflow the sample complexity was reduced by fractionation of the samples with three different electrophoretic protocols: (i) conventional SDS-PAGE with subsequent in-gel digest (“geLC-MS”), (ii) gel-free preparative protein isoelectric focusing (“offgeLC-MS”) of plasma proteins or (iii) fractionation of tryptic peptides by preparative gel-free focusing. Fractions were analyzed in the third step by nLC-MALDI-TOF/TOF MS. All three fractionation strategies again improved the yield of protein identifications, with the best results obtained for the gel-free peptide focusing. The panels of identified proteins after the three fractionation protocols were partially complementary as of the 296 identified proteins that were identified in total only 96 were detected in all three approaches. After an additional shotgun-analysis using a different protease a catalog of 480 bovine plasma proteins was finally compiled from all available data. An alternative method for the depletion of abundant serum proteins was developed based on a random observation. Dilution or dialysis of serum samples at slightly acidic pH-values resulted in the formation of a precipitate, which showed well-balanced protein concentrations similar to CPLL-extracts. The precipitate was analyzed in detail by qualitative and quantitative MS. A CPLL-extract of the same sample was analyzed in parallel as reference. BSA was removed with similar efficiency by both treatments. However, analysis by SDS-PAGE, 2DE and nLC-MALDI-TOF/TOF MS showed that the protein compositions of the two preparations significantly differed. With respect to the depletion of abundant and the enrichment of less abundant proteins both methods showed different profiles, which were characterized by quantitative MS after introduction of isotope labels. Reproducibility of both approaches was excellent. For an in-depth analysis of the precipitate, tryptic peptides were fractionated by preparative gel-free focusing and the fractions were analyzed in parallel by nLC-MALDI-TOF/TOF MS and with an Orbitrap mass spectrometer. In this way a total of 306 proteins could be identified in the precipitate. The GO analysis showed that in the precipitate typical plasma proteins were strongly enriched. Therefore, the method is an excellent complementation to the CPLL approach. Possible transmission to humans is an important aspect in the study of so-called ‘zoonotic’ viral diseases of wild and farm animals. Two pathogens with zoonotic potential are the Hendravirus (HeV) and the Nipahvirus (NiV) from the genus henipavirus. The matrix protein (M) of these viruses is involved in the assembly of virus particles and the budding process during virus release. It is hypothesized that during the nucleocytoplasmic passage that has been observed for the matrix protein, it interacts with host cell proteins that have not been identified yet. To identify such factors, protein complexes were isolated by affinity purification using strep-tagged HeV M as bait and characterized by nLC-MALDI-TOF/TOF MS. Using this approach, an interaction of ANP32B with HeV M was discovered and confirmed by further analysis. In reciprocal immunoprecipitations using tagged M and ANP32B the co-precipitation of the respective other binding partner was demonstrated. Fluorescence microscopic studies with HeV M and NiV M in transfected as well as in virus-infected cells showed, that M only accumulated in the nucleus in the presence of ANP32B. Suppression of ANP32B expression in infected cells had no influence on the budding process, showing that the nucleocytoplasmic passage is not essential for virus release.