Open Access

Boris Wilmes

• Das aus antarktischem Meereis stammende und auch bei geringen Temperaturen schnell wachsende γ Proteobakterium Pseudoalteromonas haloplanktis TAC125 (PhTAC125) ist ein Modellorganismus für kälteangepasste Bakterien und Enzyme. Zusätzlich ist es ein alternativer Expressionswirt für die lösliche Überproduktion von heterologen Proteinen, die in etablierten Expressionswirten zur Bildung von inclusion bodies neigen. Bisher sind bei PhTAC125 im Rahmen der Erforschung von Kälteanpassungsmechanismen bzw. der Optimierung des kälteangepassten Expressionssystems nur Teilaspekte der Physiologie, des Stoffwechsels und der Bioprozessoptimierung untersucht worden. Bis zum Beginn dieser Dissertation gab es kaum Experimente, die sich mit der dynamischen und nahezu ganzheitlichen Betrachtung der Veränderung zellulärer Zustände und des Stoffwechsels von PhTAC125 beschäftigt haben. Darüber hinaus sind trotz der Fortschritte bei der Etablierung von PhTAC125 als alternativer Expressionswirt die bisher erzielten Biomassekonzentrationen gering. Aus diesem Grund wurden in dieser Dissertation zur Untersuchung des Stoffwechsels die exponentielle Wachstumsphase sowie vergleichende Untersuchungen verschiedener Wachstumsphasen und zellulärer Kompartimente auf Basis der Proteomanalytik durchgeführt. Zusätzlich konnte mit Hilfe der Fed-Batch-Kultivierungstechnik die Biomassekonzentration im Vergleich zu den herkömmlichen Methoden deutlich gesteigert werden. Zur Untersuchung der Physiologie und des Stoffwechsels von PhTAC125 während des exponentiellen Wachstums wurde das Proteom analysiert. Neben den typischen stark exprimierten Kategorien der exponentiellen Wachstumsphase wie Protein- u. Nukleotidbiosynthese, Aminosäure- u. Kohlenstoffmetabolismus, stellten sich vor allem die Proteine des TonB abhängigen Transportsystems (TBDT), sowie der Kategorien Entgiftung und Coenzyme für PhTAC125 als wichtig heraus. Das TBDT ist wegen seiner hohen Abundanz im Proteom und seiner potentiellen Beteiligung am Transport von Proteinabbauprodukten für PhTAC125 ähnlich bedeutend wie die anderen Kategorien mit einer hohen Anzahl stark exprimierter Proteine. Auch die Proteine zum Schutz vor ROS (reactive oxygen species) und die der Biosynthesewege der Coenzyme sind besondere und bedeutende Merkmale von PhTAC125. Der ROS Schutz ist bei kälteangepassten Bakterien während des Wachstums bei geringen Temperaturen (≤ 20°C) mit erhöhter Sauerstofflöslichkeit und der damit verbundenen verstärkten ROS-Bildung essentiell. Die Verfügbarkeit der meisten Biosynthesewege der Coenzyme im Proteom von PhTAC125 ist ein besonderes Charakteristikum gegenüber vielen anderen Wasser- und Bodenmikroorganismen und kennzeichnet einen potentiellen Wachstumsvorteil. Zur vergleichenden Untersuchung der unterschiedlichen zellulären Kompartimente von PhTAC125 wurden 2D-Gelbilder des Cyto- und Periplasmas erstellt und gegenübergestellt. Das periplasmatische Kompartiment war wesentlich durch Signalpeptid-haltige Proteine des TBDT, Porine und periplasmatische Peptidasen und Chaperone charakterisiert. Die Untersuchung der Proteomsignaturen unter Nährstofflimitationsbedingungen basierte auf dem Vergleich der späten exponentiellen und stationären Wachstumsphase mit der exponentiellen Wachstumsphase. Beide Wachstumsphasen waren durch Kategorien mit hoher Anzahl an gering exprimierten Proteinen dominiert. Dabei handelte es sich vor allem um die Kategorien der Nukleotid-, Protein- und RNS-Biosynthese. Diese potentiell reprimierten Kategorien der späten exponentiellen und stationären Wachstumsphase waren in Verbindung mit der Limitation der meisten Aminosäuren ein deutlicher Hinweis auf die stringent response. In diesem Zusammenhang schienen die stärker exprimierten Proteine (TBDT, Porine, Peptidasen/Protease und PilQ) positiv durch die stringent response eguliert zu sein, um das Überleben unter Nährstofflimitationbedingungen zu garantieren. Bei der Bioprozessoptimierung zur Steigerung der Biomassekonzentration von PhTAC125 wurden zwei verschiedene FB-Strategien durchgeführt. Bei der ersten Strategie wurde eine komplexe Aminosäurequelle (Casamino Acids) als Substrat eingesetzt und über konstante oder exponentielle Substratzufütterungsprofile eine optische Dichte (OD) von 30 erreicht. Im Vergleich zu den bisherigen in der Literatur beschriebenen Bioprozessen von PhTAC125 wurde die finale Biomassekonzentration 3 fach erhöht. Bei der zweiten FB-Strategie wurde ein „definierteres“ Substrat bestehend aus Glycerol und Glutamat für die Fütterungslösung eingesetzt. Mit einer anfänglichen exponentiellen gefolgt von einer konstanten Fütterungsrate konnte die Biomassekonzentration (OD = 86) gegenüber den veröffentlichen Ergebnissen 8 fach gesteigert werden. Zusammenfassend konnten erste proteombasierte Aussagen zur Physiologie und zum Stoffwechsel von PhTAC125 getroffen und erste Bioprozessstrategien zur gezielten Biomassesteigerung entwickelt werden.
• Pseudoalteromonas haloplanktis TAC125 (PhTAC125) is a cold-adapted γ-proteobacterium isolated from Antarctic sea ice. It is characterised by remarkably high growth rates at low temperatures and is one of the model organisms for cold-adapted bacteria and enzymes. In addition P. haloplanktis has been suggested as an alternative host for the soluble overproduction of heterologous proteins which tend to form inclusion bodies in established expression hosts. Until now only partial aspects of its physiology and metabolism have been investigated. For this reason one focus of this dissertation was the detailed analysis of proteomic signatures under exponential growth and nutrient starvation conditions. Despite the progress in establishing P. haloplanktis as an alternative expression host, the cell densities obtained with this organism are still low. Therefore the second focus of this work was the development of fed-batch cultivation strategies for this auspicious alternative expression host to reach high biomass concentrations. The analysis of PhTAC125s physiology and metabolism of the exponential growth phase was based on the investigation of the exponential growth on a soy-peptone supplemented artificial seawater medium at 16°C. The proteome of the exponential growth phase was characterised by a high number and abdundance of proteins of typical exponential growth dependent types like amino acid and carbohydrate metabolism as well as protein and nucleotide biosynthesis. The proteins of the TonB dependent transport system (TBDT) and of the categories detoxification and coenzymes seemed to be special metabolic features of the marine microbe during exponential growth. The high number and high abundance of the TBDT proteins in the proteome and their potential role in the transport of protein degradation products emphasised their great importance for PhTAC125. Despite a lower abundance of detoxifying enzymes, they had similar prominence. These enzymes were mainly involved in the protection against reactive oxygen species (ROS) of which number is drastically increased due to higher oxygen solubility at low temperatures. The enzymes for the coenzyme biosynthesis were additionally a special characteristic of the psychrotolerant marine bacterium. These biosynthesis pathways distinguished PhTAC125s growth advantage over many other water and soil microorganisms. During the exponential growth another focus was the proteome analysis of the differences between the cyto- and periplasmatic compartments. The periplasmatic compartment was dominated by a high number of signal peptide-sequence-containing proteins mainly by TBDT, porins and periplasmatic peptidases and chaperones. The most prominent categories were the TBDT and the peptidases. They play an important role in the import of nutrients into the periplasm and are necessary for their continuative transport into the cytoplasm. Therefore these proteins seemed to be essential for P. haloplanktis. For the analysis of proteomic signatures under nutrient starvation conditions the late exponential and stationary growth phase was compared with the exponential growth phase. Both growth phases were dominated by categories with high numbers of low expressed proteins. These categories particularly included nucleotides/nucleic acids biosynthesis, protein and RNA biosynthesis. These potential repressed categories of the late exponential and stationary phase, combined with the limitation of the most amino acids, were a distinct allusion to stringent response. In this connection the stronger expressed proteins (TBDT, porins, peptidases/proteases and PilQ) seemed to be positively regulated by sringent response to guarantee the survival under nutrient limitations. The content of the last part of the dissertation were experiments to increase the biomass concentration of P. haloplanktis. Two different fed batch strategies were tested to reach higher biomass yields. The first strategy was based on continuous feeding of a complex medium containing a complex amino acid source (casamino acids). This strategy resulted in a 3-fold increase of the optical density (OD540 = 30) compared to the biomass concentrations described in the literature. The second strategy was based on a more defined feeding solution with glycerol and glutamic acid as carbohydrate and nitrogen source. The initial exponential feeding was followed by a continuous one which finally resulted in an up to 8 fold increase of the optical density (OD540 = 86) compared to literature. In summary first proteome-based conclusions of the physiology and metabolism of P. haloplanktis during exponential growth and nutrient limitation conditions could be made. Furthermore two fed batch strategies for increasing biomass yields of PhTAC125 could be established.