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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002355-9

Untersuchungen zur transkriptionellen Regulation des Transporters MRP4 (ABCC4)

  • MRP4 (multi drug resistance protein 4) ist ein Transporter aus der ATP-binding-cassette Familie (ABCC4) und verfügt über ein sehr breites Substratspektrum. Dieses beinhaltet Xenobiotika u.a. Cephalosporine, Diuretika und Zytostatika sowie endogene Substanzen wie Gallensäuren, Steroide, Eicosanoide und auch Nukleotide, wie den second messenger zyklisches AMP (cAMP). MRP4 wird in einer Vielzahl von Geweben exprimiert u.a. in der Niere, in der Leber, im Gehirn, in Blutzellen und in vaskulären glatten Muskelzellen. Über die Regulation von MRP4 ist weniger bekannt, daher war es das Ziel dieser Arbeit die transkriptionelle Regulation von MRP4 näher zu betrachten. Zur Bearbeitung dieser Zielstellung wurde die Promoter-Region des ABCC4/MRP4-Gens in ein Luciferase-Reporter-System kloniert. Anschließend wurde in Zellversuchen mit HeLa und HepG2-Zellen der Einfluss verschiedener Substanzen auf die Transkription von MRP4 untersucht. Zusätzlich wurde mittels Western Blot und quantitativer RealTime-PCR die Expression von MRP4 auf Protein- und mRNA-Ebene betrachtet. Keine bzw. nur geringe Effekte auf die Promoteraktivität wurden in den erwähnten Zelllinien u.a. nach Behandlung mit Glucocorticoiden, Zytokinen, cGMP, Nrf2-/AhR-Aktivatoren und unter dem Einfluss verschiedener Glucose-Konzentrationen beobachtet. Dagegen zeigte sich ein signifikanter Einfluss des zellulären cAMP-Spiegels. MRP4 vermittelt physiologisch einen Auswärtstransport von cAMP. Bei Inkubation mit dem membranpermeablen cAMP-Analogon Dibutyryl-cAMP zeigte sich eine signifikante Steigerung der Promoter-Aktivität von MRP4. Auch auf mRNA- und Protein-Ebene konnte eine signifikante Steigerung der Expression nach Behandlung mit cAMP detektiert werden. Durch Ko-Inkubation mit Inhibitoren der Proteinkinase A (PKA) und der Extracellular signal-regulated kinases 1/2 (Erk1/2) konnte weiterhin gezeigt werden, dass dieser Effekt nicht über die PKA, dem häufigsten Effektor von cAMP, sondern über Erk1/2 vermittelt wird. Die Induktion von MRP4 durch cAMP, welches selbst Substrat des Transporters ist, könnte eine Art Feedback-Mechanismus darstellen und darauf hinweisen, dass MRP4 eine größere Rolle im zellulären cAMP-Stoffwechsel zukommt, als bisher angenommen. Der zelluläre Export stellt neben dem Abbau von cAMP durch Phosphodiesterasen einen alternativen Mechanismus der Signalregulation dar, der entweder nur als Ventilmechanismus bei hohen cAMP-Spiegeln oder Zelltyp- und Kompartiment-abhängig möglicherweise auch als hauptsächlicher Eliminationsweg dient. MRP4 könnte somit neben der Inhibition der Phosphodiesterasen einen weiteren Angriffspunkt zur Erhöhung zellulärer cAMP-Spiegel z.B. im Rahmen der Therapie von Erkrankungen wie der pulmonalen Hypertonie darstellen.
  • MRP4 (multi drug resistance protein 4) is a transporter from the ATP-binding-cassette-family (ABCC4) and has a broad spectrum of substrates including xenobiotics like cephalosporines, diuretics and cytostatic agents as well as endogenous substances like bile acids, steroids, eicosanoids and nucleotides i.e. the second messenger cAMP. MRP4 is expressed in a variety of tissue including the kidney, liver, brain, blood cells and vascular smooth muscle cells. The regulation of MRP4 is less studied, therefore this publication is aimed at the examination of the transcriptional regulation of MRP4. The promoter region of the ABCC4/MRP4-gene was cloned into a luciferase-reporter-assay. After this the influence of various substances on the transcription of MRP4 was examined in studies with Hela- and HepG2-cells. Furthermore the expression of MRP4 on protein- and mRNA-level was studied with western blot an quantitative real-time-PCR experiments. Small to no effects on the promoter activity were seen after treatment with glucocorticoids, cytokines, cGMP, Nrf2-/AhR-activators and under the influence of varying glucose concentrations but a significant influence of the intracellular cAMP-level was observed. Physiologically MRP4 mediates an efflux of cAMP. After incubation with dibutyryl-cAMP the promoter activity of MRP4 was significantly increased. This increase was also seen on mRNA and protein level. By co-incubating the cells with inhibitors of the protein kinase A (PKA) and the extracellular signal-regulated kinases 1/2 (Erk1/2) we could also show that this effect was not mediated by the PKA, the main effector of cAMP but by Erk1/2. The induction of MRP4 by cAMP, which is also substrate of this transporter, could act as a feedback mechanism and could be a hint, that MRP4 plays a bigger role in cAMP homeostasis than formerly expected. The export of cAMP is one possible pathway for signal regulation besides the conversion by phosphodiesterases, either as a valve mechanism at high cAMP levels or, depending on tissue and cell compartiment, as the main elimination pathway. So MRP4 could be, besides the inhibition of phosphodiesterases, another possible target for the therapy of diseases like pulmonary hypertension which involve the elevation of intracellular cAMP levels.

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Metadaten
Author: Sebastian Zang
URN:urn:nbn:de:gbv:9-002355-9
Title Additional (English):Studies on the transcriptional regulation of the transporter MRP4 (ABCC4)
Advisor:Dr. Gabriele Jedlitschky
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2015/11/20
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Universitätsmedizin (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2015/10/09
Release Date:2015/11/20
Tag:MRP4
GND Keyword:Genregulation, Proteine, Transkription
Faculties:Universitätsmedizin / Institut für Pharmakologie
DDC class:600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften / 610 Medizin und Gesundheit