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Yaqing Zhu

• Bats (Chiroptera) form the second largest order of mammals and with over 1,250 species, they represent about 20% of all mammalian species worldwide. They are the only mammals with true and sustained flight and distributed all over the world except the arctic regions. Moreover, bats entered specific ecological niches and with their food spectra, they reduce different arthropod populations as well as disperse seeds and pollen of plant species in various regions and habitats. Bats also have a crucial role in spreading high-pathogenic and zoonotic viruses, harbor in general more viruses (zoonotic and non-zoonotic), and, related to the species, number even more than rodents. However, clinical symptoms of viral diseases are rarely reported in bat communities. Also seroconversions after infection were not reported for a variety of viruses found in bats. Since the incidence of virus-positive bats estimated in passive surveillance studies is usually very low, it is a question how such viruses can use bats as reservoir hosts. There is obviously a special evolutionary relationship between the pathogens and bats as hosts, which are based on possibly physiologic adaptations also in resistance and immunity. In this thesis, the two lyssaviruses, European Bat Lyssavirus 1 and 2 (EBLV-1 and -2) were chosen as a model to investigate the immune response of European bats against viral infection in vitro. Lyssaviruses are the causative agents of rabies, a fatal zoonotic disease with neurotropic characteristics. One main question to investigate was in which way bats act as reservoir host and developed a high disease resistance. The present thesis is based on three hypotheses about innate immune response against lyssavirus infection: A) In bats specific peripheral resistance mechanisms evolved which reduce the risk of systemic viral infection after a hypothesized airborne transmission and infection via nasal epithelium supported by the social structure of and communication within bat communities. B) The co-evolution of EBLV and the innate resistance of bats resulted in a very effective type I interferon response to inhibit a systemic lyssavirus infection. C) The specific physiology of body temperature of bats with daily torpor depresses the viral replication but favours the type I interferon response. To analyze the interferon-based resistance mechanisms, the type I interferon (IFN) genes of two European bats species (Eptesicus serotinus and Myotis myotis) were cloned and sequenced. Using established cell lines from the respiratory nasal epithelium (MmNep), olfactory nasal epithelium (MmNol), and Bulbus olfactorius brain (MmBr), the type I IFN response along a possible airborne infection route was investigated. The anti-viral effects and induction of IFNs/interferon stimulated genes (ISGs) in each cell line were also investigated in detail after infection in vitro. Finally, the influence of different temperatures on lyssavirus replication was analyzed in cell culture experiments. The results indicated that (a) along the hypothesized airborne infection route the susceptibility for lyssavirus infections is decreased, (b) the type I IFN activity in contrast is increased contributing to a limitation of lyssavirus replication and (c) an obvious influences of varying cultivation temperatures on the resistance against lyssavirus infections, which favor the IFN response and repressing lyssavirus replication. The result from these in vitro studies supports the hypothesis of a special co-evolution between lyssaviruses and bats. However, in vivo studies on the relevance in infected animals are missing so far. This model could also explain the generally limited pathogenicity of bat-associated viruses.
• Fledermäuse (Chiroptera) bilden die zweitgrößte Säugetiergruppe. Mit über 1.250 Arten reprä-sentieren sie etwa 20% aller Säugetierarten weltweit. Sie sind die einzigen Säugetiere, die aktiv fliegen können und sind mit Ausnahme der arktischen Regionen auf der ganzen Welt verbreitet. Fledermäuse haben spezielle ökologische Nischen besetzt und tragen durch ihre speziellen Nah-rungsspektren dazu bei, Arthropoden-Populationen zu reduzieren oder Samen und Pollen verschie-dener Pflanzenarten zu verteilen. Fledermäuse spielen jedoch auch eine entscheidende Rolle bei der Verbreitung verschiedenster hochpathogener, teils zoonotischer Viren und weisen neben den Nagetieren die höchste Dichte an verschiedenen Virusspezies auf. Klinische Symptome nach Infektion mit Viren werden jedoch selten in Fledermausgemeinschaften beobachtet. Auch eine Serokonversion, retrospektiver Beleg für eine Infektion mit diesen Viren, ist für viele in Fledermäusen nachgewiesene Viren, nicht ge-funden worden. Da die Inzidenz von Viren in passiven Surveillance-Studien meistens sehr niedrig ist, stellt sich die Frage, wie Fledermäuse als Reservoir für solche Viren dienen können. Da sehr viele dieser Viren in anderen Säugern schwerste Erkrankungen auslösen, muss es eine besondere evolutionäre Beziehung zwischen den viralen Pathogenen und den Fledermäusen als Wirt geben, die möglicherweise auf physiologische Anpassungen, auch in Bezug auf Resistenz und Immunität, beruht. In dieser Arbeit wurden zwei Lyssavirusspezies; das European Bat Lyssavirus 1 and 2 (EBLV-1 und -2) ausgewählt, um die Immunantwort von europäischen Fledermäusen gegen Virusinfektio-nen in vitro zu untersuchen. Lyssaviren sind die Erreger der Tollwut, einer tödlichen Zoonose mit neurotropen Eigenschaften. Eine wichtige Frage war, wie die Koevolution von EBLV und europäischen Fledermäusen dazu führte, dass sie Reservoir für EBLV sind und gleichzeitig eine hohe Krankheitsresistenz ausge-prägt haben. Die Arbeit beruht auf drei Hypothesen zur angeborenen Immunantwort von Fleder-mäusen bei Lyssavirus-Infektionen: A. Bei Fledermäusen haben sich spezielle Resistenzmechanismen entwickelt, die nach aerogenen Übertragung von viralen Pathogenen mit nachfolgender Infektion der peripheren Nasenepithe-lien das Risiko einer systemischen Virusinfektion verringern. B. Die Koevolution von EBLV und angeborenem Immunsystem der Fledermäusen führte zu einer besonders effektiven Typ-I-Interferonantwort, die eine systemische Ausbreitung von EBLV wirksam hemmt. C. Die spezifische Temperaturphysiologie insbesondere der tägliche Wechsel von sehr niedriger Körpertemperatur (< 30°C) und physiologischen Fieber während des nächtlichen Fluges (> 40°C) behindert die Virusreplikation, begünstigt jedoch die Typ-I-Interferonantwort. Um die Interferon-basierten Resistenzmechanismen zu analysieren, wurden die Typ-I-Interferon-Gene (IFN) zweier europäischer Fledermausarten (Eptesicus serotinus und Myotis myotis) kloniert und sequenziert. Mit etablierten Zelllinien aus dem respiratorischen Nasenepithel (MmNep), dem olfaktorischen Nasenepithel (MmNol) und dem Bulbus olfactorius (MmBr) wurde die Typ-I-IFN-Reaktion entlang eines möglichen aerogenen Infektionsweges untersucht. Die antiviralen Wirkun-gen durch Induktion von IFN und Interferon-stimulierten Genen (ISG) in jeder Zelllinie wurden in in vitro Infektionsexperimenten detailliert untersucht. Zusätzlich wurde in Zellkulturexperimenten der Einfluss unterschiedlicher Temperaturen auf die Lyssavirus-Replikation analysiert. Dabei wurden bei Fledermäusen vorkommende, tägliche Tem-peraturänderung simuliert und neben der Lyssavirus-Replikation auch die Expression von Typ I Interferonen und ISG analysiert. Die Ergebnisse zeigten, dass (a) entlang des möglichen aerogenen Infektionswegs die Empfäng-lichkeit für eine EBLV-Infektion abnimmt (b) IFN-Aktivität ansteigt und so eine Lyssavirus-In-fektion limitieren könnte und (c) die wechselnden Körpertemperaturen der Fledermäuse diese bei-den Prozesse unterschiedlich beeinflusst; die virale Replikation wird behindert, die Interferonant-wort begünstigt. Die Ergebnisse aus den in vitro Studien stützen die Hypothese einer besonderen Koevolution zwi-schen Lyssaviren und Fledermäusen, auch wenn in vivo Studien zur Relevanz im infizierten Tier bisher fehlen. Über Fledermaus-Lyssaviren hinaus gehend könnte das vorgestellte Modell auch Erklärungen für die allgemein begrenzte Pathogenität von Fledermaus-assoziierten Viren liefern.