Open Access

Joana Manuela Dias de Sousa

• Using validated analytical tools and optimized sampling procedures, it was possible to detect a vast number of metabolites from the extracellular space but also from the cytosol of B. subtilis. The results indicate that the complement of the analytical methods was suitable in the monitoring of the metabolome since it allowed a great coverage of physicochemical diverse metabolites. However, a wide number of unknown metabolites/features were also detected. Although broad databases exist that can help in the annotation of metabolites, further investigation is needed in their identification. In unpredictable changing conditions, bacterial cells possess appropriate adaptation strategies for a successful bacterial growth. These rely on sensing mechanisms that globally adjust gene expression via transcription and feedback regulations. The metabolic sensing mechanisms have emerged as key roles in the nutritional information and regulation of cell cycle processes. In this work, a new quality of information regarding the metabolism and adaptation to the absence of key signal mechanisms in B. subtilis was provided. Investigations of cells lacking Pyk uncovered alterations in the import of glucose and pyruvate from the nutritional media. These results gives insights to the pyruvate homeostasis mechanism but also brought new questions concerning the regulation of the CCR. Pyruvate wasn't susceptible to the glucose dependent CCR in Δpyk. The earlier in ux of pyruvate in these cells is in accordance to the newly discovered pyruvate transport mechanism. Also, it was speculated that the lower consumption of external glucose could be a consequence of the impairment of the PTS system in the mutant cells due to the accumulation of glycolytic metabolite FBP. In future studies, insights of the PTS system mechanism should be done in these conditions, that could comprise the determination of HPr phosphorylation and the HPrK activity. This study also arose new questions that should be address, that include the higher secretion of acetoin and 2,3-butanediol, and the lower accumulation of shikimate 3-phosphate by the mutant cells. In an untargeted metabolomic analysis, a vast number of altered features were suggested to be fatty acids metabolites, precursors of phospholipids and LTA. Complementary approaches should be done for the confirmation of these metabolites and the inspection of possible alterations in the membrane structure. In the study of LTA mutants, the accumulation of PG precursors provided a hint of altered cell wall assembly. Although by uorescence microscopy no clear changes were detected, the metabolic results emphasized the previous assumption of the affected hydrolytic activity occurring in the PG. For comprehensive knowledge of the cell wall it would be important to detect and identify more metabolites of the LTA anchor using optimized cromatographic method. These results could be complemented with other omics data sets studies which would help in the elucidation of these key regulatory systems mechanisms.
• Die Entwicklung tragfähiger Protokolle und der Fortschritt bei den Analyseinstrumenten und der Analyse metabolischer Daten haben die Metabolomik zu einem breiteren und zugänglichen Spektrum von Forschungsgebieten, wie der mikrobiellen Metabolomik, angespornt. Die Umweltbedingungen und die Verfügbarkeit der Nahrung spielen eine entscheidende Rolle für die Größe der Bakterienzellen. Die Untersuchung der geeigneten metabolischen Reaktionen auf die Ernährungsumstellung und die Anpassung des Zellzyklus hat sich als ein grundlegendes Thema in der Mikrobiologie herausgestellt. In dieser Studie wurde B. subtilis, das am besten charakterisierte Mitglied und referenzierte Modell der grampositiven Bakterien, untersucht, mit dem Ziel, eine bessere Kenntnis der metabolischen Sensorik unter verschiedenen Bedingungen zu erlangen. In dieser Arbeit wurde eine neue Qualität von Informationen über den Stoffwechsel und die Anpassung von B. subtilis an das Fehlen der wichtigsten Signalmetaboliten Pyruvat und UDP-Glukose bereitgestellt. Diese Metaboliten und ihre jeweiligen Signalmechanismen wurden mit der Lokalisierung und Montage von Zellteilungs-Maschinen zur Nährstoffinformation in B. subtilis in Verbindung gebracht. Dabei wurden in dieser Studie die metabolischen Veränderungen im extrazellulären Raum und im Zytosol von B. subtilis, ausgelöst durch das Fehlen dieser beiden möglichen Signalmetaboliten, umfassend beobachtet. Bei Untersuchungen an Zellen ohne Pyk wurden Veränderungen beim Import von Glukose und Pyruvat aus den Nährmedien festgestellt. Diese Ergebnisse geben Einblicke in den Pyruvat-Homöostasemechanismus, stellen aber auch neue Fragen zur Regulierung des Carbon Catabolite Repression Control Systems. Was das Fehlen von UDP-Glukose betrifft, so führte dies zur Anhäufung von Peptidoglykan-Vorläufern. Dies deutet auf eine veränderte Zellwandanordnung hin und unterstreicht die bisherige Annahme der betroffenen hydrolytischen Aktivität im Peptidoglykan unter diesen Bedingungen. Insgesamt trugen die vorgestellten Arbeiten dazu bei, die beiden vorgeschlagenen metabolischen Netzwerke als Schlüsselsignale für die Anpassung an die Umweltbedingungen in B. subtilis zu entwirren.