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Genome-wide responses and regulatory mechanisms to thiol-specific electrophiles in Bacillus subtilis

  • The soil-dwelling bacterium Bacillus subtilis is regarded as model organism for functional genomic research of low GC Gram-positive bacteria. Recently, the group of Haike Antelmann has monitored the expression profile of B. subtilis after exposure to phenolic compounds. Interestingly, proteome and transcriptome analyses showed a strong overlap in the expression profile after exposure to catechol, MHQ that auto-oxidized to quinones and the thiol-reactive electrophile diamide. The response to electrophilic quinones and diamide is governed by a complex network of transcription factors, including Spx, CtsR, PerR, CymR and the novel MarR-type repressors MhqR (YkvE), YodB and YvaP. The regulatory mechanisms of these novel thiol-stress sensors YodB and YvaP are studied as part of this thesis in collaboration with the group of Peter Zuber (Oregon). YodB negatively regulates the expression of the nitroreductase YodC and the azoreductase YocJ (AzoR1) after exposure to electrophilic quinones and diamide. The azoreductase AzoR1 is a paralog of AzoR2 that is under control of MhqR. Both paralogous azoreductases (AzoR1 and AzoR2) have common functions in quinone and azo-compound reduction to protect cells against the thiol reactivity of electrophiles. DNA binding activity of YodB is directly inhibited by thiol-reactive compounds in vitro. Mass spectrometry approaches suggested that YodB is regulated by a thiol-(S)-alkylation mechanism in response to quinones. Mutational analyses revealed that the conserved Cys6 residue of YodB is required for optimal repression in vivo and in vitro. Recent studies further suggest that YodB is redox-regulated by intersubunit disulfide formation in vivo by diamide. In addition to the azoreductases, several thiol-dependent dioxygenases confer resistance to quinones. In collaboration with Kazuo Kobayashi (Nara), the YodB-paralogous MarR/DUF24-family regulator, YvaP was identified as repressor of the catechol-2,3-dioxygenase encoding yfiDE (catDE) operon. DNA binding activity of YvaP was also directly inhibited by quinones and diamide in vitro indicating that also YvaP is regulated via post-translational modifications. Mutational analyses showed that the conserved Cys7 is essential for YvaP regulation in vivo and serves as sensor for thiol-reactive compounds. In addition, also the basic amino acids K19, R20 are essential for YvaP repression in vivo as well as conserved basic arginine and lysine residues located in the DNA binding helix-turn-helix (HTH) motif. Non-reducing PAGE analysis suggests the formation of an intersubunit disulfide bond in a YvaP dimer upon treatment with quinones and diamide in vitro. Besides quinones, also aldehydes are electrophilic compounds which react via the thiol-(S)-alkylation reaction with thiols. Thus, we were also interested in the response of B. subtilis to the toxic electrophiles methylglyoxal (MG) and formaldehyde (FA). We analyzed the changes in the transcriptome and proteome of B. subtilis after exposure to MG and FA. Like quinone compounds, both MG and FA induce the thiol-specific stress response. Metabolomic approaches confirmed that these reactive aldehydes deplete the cellular thiol pool and thus act like quinones as another class of thiol-reactive electrophiles. Additionally, MG and FA also triggered responses to overcome DNA damage. Our studies further revealed the specific induction of two FA detoxification pathways regulated by the MarR/DUF24 family repressor HxlR, and the novel MerR/NmlR-type regulator YraB (AdhR). HxlR positively regulates the hxlAB operon encoding the ribulose monophosphate pathway. AdhR positively regulates an adhA-yraA operon that encodes the thiol-dependent formaldehyde dehydrogenase (AdhA) and the DJ1/PfpI-like cysteine proteinase (YraA), and the yraC gene that encodes a γ-carboxymuconolactone decarboxylase. Thus, the AdhR regulon is involved in the detoxification of FA to formate via the formaldehyde dehydrogenase AdhA which catalyzes the cleavage of S-hydroxymethylcysteine adducts. In addition, the cysteine proteinase YraA could be involved in the degradation of S-hydroxymethylcysteine-modified and damaged protein thiols. In collaboration with the group of John Helmann (Ithaca), it was shown that AdhR binds in vitro to a conserved inverted repeat between the -10 and -35 promoter elements upstream of adhA, yraB and yraC. In addition, we showed that the conserved Cys52 of AdhR is essential for aldehyde sensing and activation of adhA-yraA transcription in vivo. Thus, we speculate that redox regulation of AdhR involves thiol-(S)-alkylation of this Cys52 residue by aldehydes as another novel mechanism of bacterial physiology.
  • Die Antwort auf Elektrophile Chinone und diamide wird durch ein komplexes Netzwerk von Transkriptionsfaktoren, einschliesslich Spx, CtsR, PerR, CymR und der Roman MarR-Typ repressors MhqR (YkvE), YodB und YvaP. Die regulatorischen Mechanismen dieser Roman thiol-Stress-Sensoren YodB und YvaP sind studierte im Rahmen dieser Diplomarbeit in Zusammenarbeit mit der Gruppe von Peter Zuber (Oregon). YodB negativ reguliert die Expression des nitroreductase YodC und die azoreductase YocJ (AzoR1) nach Exposition gegenüber elektrophilen Chinone und diamide. Die azoreductase AzoR1 ist ein paralog der AzoR2, die unter der Kontrolle von MhqR. Beide paralogous azoreductases (AzoR1 und AzoR2) haben gemeinsame Funktionen in Chinonfunktion und Azo-Compound-Reduzierung zum Schutz der Zellen gegen die thiol Reaktivität von electrophiles. DNA-bindende Aktivität von YodB ist direkt gehemmt durch thiol-reaktive Verbindungen in vitro. Massenspektrometrie Ansätze vorgeschlagen, dass YodB wird durch ein thiol-(S)-Alkylierung Mechanismus in Reaktion auf Chinone. Die Mutationsanalyse Analysen ergeben, dass die erhaltenen Cys6 Rückstand von YodB ist erforderlich für eine optimale Unterdrückung in vivo und in vitro. Neuere Studien deuten darauf hin, dass weitere YodB ist Redox-durch intersubunit-Disulfid-Bildung in vivo durch diamide. Zusätzlich zu den azoreductases, mehrere thiol-abhängigen dioxygenases eine Resistenz gegen Chinone. In Zusammenarbeit mit Kazuo Kobayashi (Nara), die YodB-paralogous MarR/DUF24-family Regulierungsbehörde, YvaP wurde als Repressor der Katechol-2,3-dioxygenase Codierung yfiDE (catDE) Operon. DNA-bindende Aktivität von YvaP wurde auch direkt gehemmt durch Chinone und diamide in vitro darauf hinweist, dass auch YvaP geregelt ist per Post-translationale Modifikationen. Die Mutationsanalyse Analysen zeigten, dass die erhaltenen Cys7 ist eine wesentliche Voraussetzung für YvaP Verordnung in vivo und dient als Sensor für thiol-reaktive Verbindungen. Darüber hinaus, auch die grundlegenden Aminosäuren K19, R20 sind von wesentlicher Bedeutung für YvaP Repression in vivo als auch konserviert grundlegenden Arginin und Lysin Rückstände in der DNA-bindenden Helix-Turn-Helix (HTH) Motiv. Nicht-Reduzierung PAGE Analysen schlägt die Bildung einer intersubunit-Disulfid-Bindung in einer YvaP Dimer auf die Behandlung mit Chinonen und diamide in vitro. Neben Chinone, auch Aldehyde sind Elektrophile Verbindungen reagieren, die über die thiol-(S)-Alkylierung Reaktion mit Thiolen. So waren wir auch daran interessiert, die Antwort von B. subtilis, um die toxischen electrophiles methylglyoxal (MG) und formaldehyd (FA). Wir analysierten die Veränderungen in der Transkriptom und Proteom von B. subtilis nach Exposition gegenüber MG und FA. Wie Chinonfunktion Verbindungen, die beide MG und FA induzieren die thiol-spezifischen Stress Reaktion. Metabolomic Ansätze bestätigt, dass diese reaktive Aldehyde Abbau der zellulären thiol Pool und so handeln wie Chinone als eine weitere Klasse von thiol-reaktive electrophiles. Ausserdem, MG und FA passen auch Antworten zu überwinden DNA-Schäden. Unsere weitere Studien ergeben, die spezifischen Induktion von zwei FA Entgiftung Wege durch das MarR/DUF24 Familie Repressor HxlR, und der Roman MerR/NmlR-Typ Regulierungsbehörde YraB (AdhR). HxlR positiv regelt die hxlAB Operon-Codierung der Ribulose monophosphat Weg. AdhR positiv regelt ein adhA-yraA Operon kodiert, dass die thiol-abhängigen Formaldehyd-Dehydrogenase (AdhA) und die DJ1/PfpI-like Cystein Proteinase (YraA), und die yraC, dass Gen kodiert für ein γ-carboxymuconolactone Decarboxylase. So, die AdhR Regulon ist an der Entgiftung von FA zu formate über die Formaldehyd Dehydrogenase AdhA, die katalysiert die Spaltung von S-hydroxymethylcysteine Addukte. Darüber hinaus ist die Cystein Proteinase YraA könnte einbezogen werden in die Erschöpfung der S-hydroxymethylcysteine veränderte und beschädigt Protein Thiolen. In Zusammenarbeit mit der Gruppe von John Helmann (Ithaca), konnte gezeigt werden, dass AdhR bindet in vitro zu einer invertierten wiederholen konserviert zwischen den -10 und -35 Promotor Elemente der Upstream-Adha, yraB und yraC. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass die erhaltenen Cys52 der AdhR ist eine wesentliche Voraussetzung für Aldehyd Erkennung und Aktivierung von Adha-yraA Transkription in vivo. So, wir spekulieren, dass Redox-Regulierung der AdhR beinhaltet thiol-(S)-Alkylierung dieser Cys52 Rückstand durch Aldehyde wie ein anderes neuen Mechanismus der bakteriellen Physiologie.

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Metadaten
Author: Nguyen Thi Thu Huyen
URN:urn:nbn:de:gbv:9-000527-5
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2008/10/22
Release Date:2008/10/22
GND Keyword:AdhA, AdhR, Bacillus subtilis, MarR-type regulator, YodB, YraA, YvaP, aldehydes, dioxygenase, quinone, thiol stress
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Mikrobiologie - Abteilung für Genetik & Biochemie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie