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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-001652-4

Purinarme Lebensmittel – Enzymatische Reduktion von Purinen in Lebensmitteln

  • Ziel dieses Projektes war die Entwicklung eines neuen Ansatzes zur Senkung der Harnsäurekonzentration im Blutserum von Patienten mit Hyperurikämie und der damit verbundenen Verringerung der Anzahl von schmerzhaften Gichtanfällen. Dafür sollten Purine in Lebensmitteln mit einem Gemisch aus purinabbauenden Enzymen zu dem gut löslichen Allantoin abgebaut werden. Durch diesen neuen Ansatz ist eine abwechslungsreiche Ernährung von Hyperurikämiepatienten ohne oder mit reduzierter zusätzlicher medikamentöser Behandlung zur Senkung der Harnsäurebildung, Erhöhung der Harnsäureausscheidung bzw. enzymatischen Reduktion von Harnsäure möglich. Die Analyse des Wachstumsverhaltens von Arxula adeninivorans LS3 zeigte die Vermehrung des Zellmaterials in einer Kultivierung mit Adenin als Kohlenstoff- und Stickstoffquelle bzw. mit Hypoxanthin und Harnsäure als alleiniger Stickstoffquelle. Die Fähigkeit des Wachstums mit Adenin, Hypoxanthin oder Harnsäure als alleiniger Stickstoffquelle bestätigte das Vorhandensein des Purinabbauweges in der nicht-konventionellen Hefe A. adeninivorans LS3. Das Guanin-Deaminase-Gen (AGDA) aus A. adeninivorans LS3 kodierte für ein Protein aus 475 Aminosäuren, das in der Zelle als Dimer vorlag (55 kDa je Untereinheit). Das Guanin-Deaminase-Protein (Agdap) zeigte eine Homologie auf Aminosäureebene zwischen 44 und 55 % zu anderen pilzlichen Guanin-Deaminasen. Beim Wachstum auf Medien mit Adenin, Hypoxanthin oder Guanin als alleiniger Stickstoffquelle erfolgten eine Induktion der Genexpression des AGDA-Gens sowie eine intrazelluläre Akkumulation des Guanin-Deaminase-Proteins in der Vakuole wie auch dem Zytoplasma der Hefezelle. Einen weiteren Schwerpunkt dieser Arbeit bildete die biochemische Charakterisierung der Uratoxidase. Das Uratoxidase-Gen (AUOX) aus A. adeninivorans LS3 lag auf Chromosom 4 und kodierte für das Uratoxidase-Protein (Auoxp) mit 306 Aminosäuren. Bei dem Auoxp handelte es sich um ein 35 kDa großes Protein, das als Dimer in der Zelle vorlag. Ein Vergleich mit anderen pilzlichen Uratoxidasen ergab eine Homologie von 61 bis 65 % auf der Ebene der Aminosäuresequenz. Das Enzym zeigte konservierte Sequenzmotive, die in den Uratoxidasen einer Vielzahl von Organismen beschrieben wurden. Die AUOX-mRNA-Konzentration stieg bei Wachstum auf Medien mit Harnsäure, Adenin und Hypoxanthin als alleiniger Stickstoffquelle. Die Akkumulation von Auoxp zeigte einen Maximalwert nach achtstündiger Kultivierung im Medium mit Harnsäure und zeitlich verschoben mit den Stickstoffquellen Adenin bzw. Hypoxanthin (nach 12 Stunden). Der biotechnologische Einsatz der purinabbauenden Enzyme der Hefe A. adeninivorans erforderte eine Überexpression der Uratoxidase- bzw. der Guanin-Deaminase-Gene in transgenen A. adeninivorans-Stämmen aufgrund zu niedriger, natürlicher Expressionshöhe im Wildtypstamm LS3. Als Transformations-/Expressionssystem fand das etablierte Xplor®2-Vektorsystem Verwendung. Diese Plattform bietet den Vorteil, dass keine Resistenzgene in die Hefe übertragen werden. Die Hefen wurden mit unterschiedlichen Expressionsmodulen transformiert, um die optimalen Expressionsbedingungen für die Guanin-Deaminase bzw. die Uratoxidase zu ermitteln. Vergleichende Untersuchungen bezüglich der Integrationshäufigkeit, dem Wirtsorganismus (homolog/heterolog) und der optimalen Expression (konstitutiv/induziert) zeigten, dass A. adeninivorans ein geeigneter Organismus für die Expression des Guanin-Deaminase- bzw. Uratoxidase-Gens darstellte. Für weiterführende Analysen erfolgte die nähere Untersuchung der Hefetransformanden mit der höchsten Guanin-Deaminase-Aktivität bzw. der über einen längeren Zeitraum konstant hohen Uratoxidase-Aktivität. Das über den C-terminalen His-Tag gereinigte rekombinante Protein zeigte eine hohe Übereinstimmung der biochemischen Eigenschaften (Substratspektrum, intrazelluläre Lokalisation, usw.) im Vergleich zum endogenen Protein der Hefe A. adeninivorans LS3 (nach induzierter Genexpression). Die rekombinanten Enzyme des Purinabbauweges (Uratoxidase, Guanin-Deaminase, Adenin-Deaminase und Xanthin-Oxidoreduktase) bewirkten nach deren Zugabe zu einem reinen Puringemisch aus Adenin, Guanin, Xanthin, Hypoxanthin und Harnsäure eine Reduktion der Konzentration sämtlicher Purine. Das Gemisch aus purinabbauenden Enzymen der Hefe A. adeninivorans belegte bei ersten Anwendungen in einem Lebensmittel (Rinderbrühe) die abbauende Wirkung auf sämtliche, im Lebensmittel befindlichen, Purine. Es gelang in dieser Arbeit, den Puringehalt eines Lebensmittels mit in transgenen A. adeninivorans-Stämmen hergestellten Proteinen enzymatisch abzubauen.
  • The aim of the project was the development of a new approach for the lowering of the uric acid concentration in the blood serum of patients with hyperuricemia and the associated reduction of the number of painful gout attacks. Therefore, purines in food should be degraded to the more soluble allantoin by a mixture of enzymes. Due to this new approach, a varied diet is possible for hyperuricemia patients with reduced or without additional drug treatment for lowering uric acid synthesis, increasing excretion of uric acid or enzymatic degradation of uric acid. The analysis of growing behavior of Arxula adeninivorans LS3 showed the increase of cell material in cultures with adenine as carbon and nitrogen sources or hypoxanthine and uric acid as sole nitrogen sources. The ability of growing with adenine, hypoxanthine or uric acid as sole nitrogen sources confirmed the presence of a purine degrading pathway in the non-conventional yeast Arxula adeninivorans LS3. The guanine deaminase gene (AGDA) of Arxula adeninivorans LS3 encoded a protein of 475 amino acid which was present in the cell as a dimer (55 kDa each subunit). The guanine deaminase protein (Agdap) showed 44 to 55 % homology to the amino acid sequences of other fungal guanine deaminases. Growth on media containing adenine, guanine or hypoxanthine as sole nitrogen sources led to an induction of gene expression of the AGDA gene and intracellular accumulation of guanine deaminase protein in the vacuole as well as the cytoplasm of the yeast cell. A further focus of this thesis included the biochemical characterization of the urate oxidase. The urate oxidase gene (AUOX) from Arxula adeninivorans LS3 was located on chromosome 4 and encoded a 306 amino acid urate oxidase protein (Auoxp). The 35 kDa protein Auoxp was presented as a dimer in the cell. A comparison of amino acid sequences to other fungal urate oxidases showed a homology between 61 and 65 %. The protein owned conserved motives that have been described in the urate oxidases of a variety of organisms. The mRNA concentration of AUOX increased in presence of uric acid, adenine and hypoxanthine as sole nitrogen sources. The accumulation of Auoxp was maximal after eight hours in presence of uric acid and temporary displaced with the nitrogen sources adenine or hypoxanthine (maximum 12 hours). The biotechnological application of the purine degrading enzymes of A. adeninivorans required an overexpression of the urate oxidase and guanine deaminase gene in transgenic A. adeninivorans strains due to a low natural expression level in the wild type strain LS3. The established transformation/expression platform Xplor®2 was used. The advantage of this platform is the transformation without any resistance gene. The yeast was transformed with different expression modules for optimization of expression of urate oxidase and guanine deaminase. Comparative studies on the frequency of integration, the host organism (homologous/heterologous) and optimal expression (induced/ constitutive) showed that A. adeninivorans represented a suitable organism for expression of the urate oxidase and the guanine deaminase gene. For further analysis, the yeast transformants with highest guanine deaminase activity and over a longer period constant urate oxidase activity were analyzed. Over C-terminal his-tag purified recombinant enzymes showed high conformance of biochemical properties (substrate spectra, intracellular localization) compared with endogenous protein of the yeast A. adeninivorans LS3 (after induced gene expression). The recombinant enzymes of purine degrading pathway (urate oxidase, guanine deaminase, adenine deaminase and xanthine oxidoreductase) caused the reduction of purine concentration in a mixture with adenine, guanine, xanthine, hypoxanthine and uric acid. The mixture of purine degrading enzymes of A. adeninivorans documented as first application in food (beef stock) the degrading effect to all in this food presented purines. In this work, the purine content of food was enzymatically reduced with produced proteins of transgenic A. adeninivorans strains.

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Metadaten
Author: Anke Trautwein-Schult
URN:urn:nbn:de:gbv:9-001652-4
Title Additional (English):Low purine food – enzymatic reduction of purines in food
Advisor:Prof. Dr. Gotthard Kunze
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2013/11/28
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2013/10/30
Release Date:2013/11/28
Tag:Guanin-Deaminase, Uratoxidase, Xplor2® Transformations-/Expressionssystem
GND Keyword:Arxula adeninivorans, Biochemische Analyse, Enzym, Harnsäure, Lebensmittel, Purinderivate
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Mikrobiologie - Abteilung für Genetik & Biochemie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie
MSC-Classification:92-XX BIOLOGY AND OTHER NATURAL SCIENCES / 92Cxx Physiological, cellular and medical topics / 92C40 Biochemistry, molecular biology