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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-001993-0

Comparative analysis of repressor interaction with pleiotropic corepressors Sin3 and Cyc8 in the yeast Saccharomyces cerevisiae

  • Transcriptional repression of regulated structural genes in eukaryotes often depends on pleiotropic corepressor complexes. A well-known corepressor conserved from yeast to mammalian systems is Sin3. In addition to Sin3, yeast Cyc8/Tup1 corepressor complex also regulates a diverse set of genes. Both corepressors can be recruited to target genes via interaction with specific DNA-binding proteins, leading to down-regulation of a large number of unrelated structural genes by associated histone deacetylases (HDACs). In vitro interaction studies performed in this work by GST pull-down assays showed that various repressor proteins (such as Whi5, Stb1, Gal80, Rfx1, Ure2, Rdr1, Xbp1, Yhp1, Rox1, Yox1, Dal80 and Mot3) are indeed able to bind pleiotropic corepressors Sin3 and/or Cyc8/Tup1. All repressors interacting with Sin3 contact its paired amphipathic helix domains PAH1 and/or PAH2. Mapping experiments allowed the characterization of minimum repressor domains and to derive a sequence pattern which may be important for repressor interaction with Cyc8 or Sin3. Interactions for some pathway-specific repressors such as Cti6 and Fkh1 have been studied comprehensively; minimal domains of Cti6 and Fkh1 required for interaction with Sin3 have been mapped and subsequently investigated by mutational analysis. In vitro interaction studies could show that amino acids 350-506 of Cti6 bind PAH2 of Sin3. To analyze this Cti6-Sin3 interaction domain (CSID) in more detail, selected amino acids within CSID were replaced by alanine. It turned out that hydrophobic amino acids V467, L481 and L491 L492 L493 are important for Cti6-Sin3 binding. The results of this work also suggest that repression is not executed entirely via Sin3, but rather CSID is also important for contacting pleiotropic corepressor Cyc8. In addition to PAH2 of Sin3, CSID also binds to tetratricopeptide repeats (TPR) of Cyc8. Furthermore, in vitro mapping studies revealed that Fkh1 also binds PAH2 of corepressor Sin3 via its N-terminal domain (aa 51-125). Binding studies with mutagenized Fkh1-Sin3 interaction domain (FSID) showed that Fkh151-125 variants L74A and I78A were unable to bind PAH2 of Sin3. Confirming in vitro studies, Cti6350-506 and Fkh151-125 also displayed in vivo interaction with PAH2 of Sin3 by using the “yeast two -hybrid” system. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) analyses have demonstrated Cti6 recruitment to promoters of genes such as RNR3 and SMF3 containing iron responsive elements (IRE). Importantly, Sin3 was also recruited to these promoters but only in the presence of functional Cti6. Similarly, recruitment of Fkh1 and Sin3 to promoters of cell-cycle regulated genes CLB2 and SWI5 was shown. Recruitment of Sin3 was completely Fkh1-dependent. Additional findings of this work shed light on the fact that not only repressor proteins may contact Sin3 but also activator proteins not yet considered for interaction, e. g. specific activators such as Pho4 and Ino2. These findings indicate that Sin3 may fulfill functions beyond acting as a corepressor. In vitro studies on Sin3-Pho4 interaction showed that aa 156-208 of Pho4 are able to bind both PAH1 and PAH2 of Sin3, while an internal region of Ino2 comprising amino acids 119-212 binds to both Sin3 and Cyc8.
  • Die transkriptionale Repression regulierter eukaryotischer Strukturgene erfolgt oft über pleio¬trope Corepressor-Komplexe. Der Sin3-Corepressor ist ein globaler Regulator der Transkription in Eukaryoten von der Hefe bis hin zum Menschen. Neben Sin3 und seinen assoziierten Proteinen gibt es in der Hefe S. cerevisiae einen weiteren Komplex, der in der Lage ist, inhibierend auf die Transkription zu wirken, nämlich den Cyc8/Tup1-Komplex. Beide Corepres¬soren können die lokale Chromatinstruktur verändern, in dem sie durch Interaktion mit spezi¬fischen DNA-binden-den Proteinen zu ihren Zielgenen rekrutiert werden, was zur Repression vieler unabhängiger Strukturgene durch Histon Deacetylasen (HDACs) führt. Die in dieser Arbeit durchgeführten in vitro Interaktionsanalysen haben gezeigt, dass diverse spezifische Repressoren (z. B. Whi5, Stb1, Gal80, Rfx1, Ure2, Rdr1, Xbp1, Yhp1, Rox1, Yox1, Dal80 und Mot3) tatsächlich die pleiotropen Corepressoren Sin3 und/oder Cyc8/Tup1 binden können. Alle Repressoren, die mit Sin3 wechselwirken, kontaktieren dessen Domänen PAH1 oder PAH2 ("paired amphipathic helix"). Durch Kartierungsexperimente konnten minimale Repressordomänen charakterisiert werden, die die Interaktion zu Sin3 bzw. Cyc8 vermitteln. Daraus ließ sich ein Sequenzmuster ableiten, das für die Repressorinter¬aktion mit Sin3 oder Cyc8 wichtig sein könnte. Ferner wurden die Interaktionen der spezifischen Repressoren Cti6 und Fkh1 intensiver untersucht. Cti6 kann über seine Cti6-Sin3 Interaktionsdomäne (CSID; AS 450-506) mit der PAH2 des Corepressors Sin3 interagieren. Ausgewählte Aminosäuren in der CSID wurden durch gerichtete Mutagenese gegen Alanin ausgetauscht und die erhaltenen Cti6 Varianten auf ihre Repressorfunktion hin untersucht. Die Substitution einzelner Aminosäuren innerhalb der CSID offenbarte die Notwendigkeit der Aminosäuren V467, L481 und L491 L492 L493 für die Cti6-Sin3 Bindung. Die Ergebnisse legten außerdem nahe, dass die Repression nicht allein über Sin3 vermittelt wird. Tatsächlich konnte gezeigt werden, dass die innerhalb der CSID von Cti6 kritischen Aminosäuren der Cti6-Sin3 Bindung (V467, L481 und L491 L492 L493) auch für die Interaktion von Cti6 mit Cyc8 wichtig sind. Dementsprechend rekrutiert Cti6 mit Hilfe der CSID neben der PAH2 von Sin3 auch die TPR-Motive im Cyc8. Ferner wurde gezeigt, dass Fkh1 über seine N-terminale Fkh1-Sin3 Interaktionsdomäne (FSID; AS 51-125) mit Sin3 interagiert. Bindungsstudien mit einer mutierten Fkh1-Sin3 Interaktionsdomäne (FSID) zeigten, dass die Fkh151-125 Varianten L74A und I78A nicht in der Lage waren, an die PAH2 von Sin3 zu binden. Mit Hilfe des "Two Hybrid" Systems wurde auch in vivo festgestellt, dass die Domänen Cti6350-506 und Fkh151-125 mit der PAH2 von Sin3 wechselwirken. Mittels Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) konnte gezeigt werden, dass Cti6 an Promotoren von Genen wie z. B. RNR3 and SMF3, die sog. „iron responsive elements“ (IRE) enthalten, rekrutiert wird. Auch Sin3 konnte an diese Promotoren binden, jedoch nur in Gegenwart eines intakten Cti6. Eine entsprechende Rekrutierung von Fkh1 und Sin3 an Promotoren Zellzyklus-regulierter Gene wie CLB2 and SWI5 wurde gezeigt, wobei die Sin3-Rekrutierung Fkh1-abhängig erfolgte. Ferner stellte sich heraus, dass nicht nur Repressoren, sondern auch Aktivatoren wie z. B. Pho4 und Ino2 eine Interaktion mit Sin3 eingehen. Dies deutet darauf hin, dass der Sin3-Komplex auch Funktionen über die eines Corepressors hinaus erfüllt. In vitro Untersuchungen zur Sin3-Pho4 Interaktion zeigten, dass die AS 156-208 von Pho4 in der Lage sind, PAH1 und PAH2 im Sin3 zu binden. Eine interne Region von Ino2, bestehend aus den Aminosäuren 119-212, bindet sowohl an Sin3 als auch Cyc8.

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Metadaten
Author: Rasha Aref
URN:urn:nbn:de:gbv:9-001993-0
Title Additional (German):Vergleichende Analyse der Repressor Wechselwirkung mit pleiotropen Korepressoren Sin3 und Cyc8 in der Hefe Saccharomyces cerevisiae
Advisor:Prof. Dr. Joachim Schüller
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2014/09/12
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2014/09/09
Release Date:2014/09/12
GND Keyword:Hefe, Repressoren
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Mikrobiologie - Abteilung für Genetik & Biochemie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie