Open Access

Beate Matzkeit

• Toxoplasma gondii ist ein weltweit vorkommender einzelliger Parasit mit hohem zoonotischen Potential. In Nordamerika und Europa haben sich drei klonale Toxoplasma-Linien durchgesetzt, Typ I, Typ II und Typ III. Sie unterscheiden sich hinsichtlich ihrer Virulenz in Labormäusen: Toxoplasma gondii vom Typ I gilt im Allgemeinen als hochvirulent, wohingegen Typ II und III wenig virulent in Labormäusen sind. In Deutschland dominieren T. gondii vom Typ II. Trotz selten vorkommender natürlicher sexueller Rekombinationen von T. gondii in Deutschland konnten in einer vorausgegangenen Studie rekombinante T. gondii-Typ II-III-Oozysten aus dem Kot einer natürlich infizierten Katze in Deutschland isoliert werden. Mittels klonaler Vereinzelung wurden in einer weiteren vorausgegangenen Studie aus diesen Oozysten die fünf Tachyzoiten-Klone B6-H6, 2-C10, 2-H8, C12 und A7 generiert, die sich in der Verteilung ihrer Typ II- und III-Allele voneinander unterschieden. Ziel dieser Arbeit war es, die fünf Klone vergleichend zu untersuchen hinsichtlich ihrer Geno- und Phänotypen. Besonderes Augenmerk wurde dabei auf die bekannten polymorphen Virulenzfaktoren ROP18, ROP5, ROP16 und GRA15 gelegt, die maßgeblich für Unterschiede in der Labormausvirulenz zwischen den klonalen Linien sorgen können. ROP18 und ROP5 sind an der Inhibition der IRG-vermittelten Zerstörung der parasitophoren Vakuole, dem Hauptabwehrmechanismus in Mäusen, beteiligt. Während alle fünf Klone das virulente Allel von ROP5 besaßen, hatten nur zwei der fünf Klone, B6-H6 und 2-C10, das virulente Allel von ROP18, dessen virulenter Genotyp in einer hohen Expression resultiert. Diese beiden Klone lösten auch eine 100 %-ige Mortalität in den infizierten BALB/c-Mäusen aus. Hier stimmte der virulente ROP18-Genotyp mit der hohen Mausvirulenz überein. Die anderen drei Klone, 2-H8, C12 und A7, besaßen das nicht virulente Allel von ROP18. Von letzteren drei Klonen lösten jedoch lediglich nur C12 und A7 eine geringere, 30 %-ige Mortalität in infizierten BALB/c-Mäusen aus. Hier würde der nicht-virulente ROP18-Genotyp die niedrigere Virulenz erklären. Der Klon 2-H8, der ebenso ein nicht-virulentes ROP18-Allel besaß, löste dagegen eine 100 %-ige Mortalität aus. Demnach ließe sich die Virulenz der infizierten BALB/c-Mäuse in dieser Studie nur in vier von fünf Klonen mit dem ROP18-Genotypen erklären. Neben ROP5 und ROP18 wurden auch die Virulenzfaktoren ROP16 und GRA15 untersucht. Diese regulieren das Zytokinprofil in infizierten Makrophagen und können dadurch Einfluss auf den klinischen Verlauf der Infektion nehmen. Von ROP16 und GRA15 besaßen jeweils alle fünf Klone das virulente Allel. Daher kann auch der Genotyp dieser Virulenzfaktoren hier nicht alleine die Unterschiede in der BALB/c-Mausvirulenz erklären. Auch das Expressionsprofil der Virulenzfaktoren in in-vitro inokulierten J-774A.1-Makrophagen mit geringen, wahrscheinlich nicht biologisch relevanten Abweichungen, ließ keine eindeutigen Rückschlüsse für die Ursache der unterschiedlichen Mausvirulenzen zu. Die in-vitro-Inokulation von J-774A.1-Makrophagen mit den Klonen ergab weiterhin, dass der mittelvirulente Klon C12 in der Lage war, die Makrophagen deutlich früher zu infizieren und eine höhere IL-12-Expression hervorzurufen. In überlebenden BALB/c-Mäusen verursachte er einen geringeren Gewichtsverlust gegenüber den anderen Klonen. Es kann für diese Studie festgehalten werden, dass sich die Virulenz der Klone in Labormäusen nicht allein durch das Vorhandensein virulenz-vermittelnder ROP18- oder anderer Virulenzgene erklären ließ. Durch die sexuelle Rekombination zwischen T. gondii des Typs II und III waren offenbar Allelkombinationen entstanden, welche auf ein komplexes multifaktorielles Netzwerk schließen lässt, das ursächlich für die Unterschiede in der Mausvirulenz und der Makrophagenfunktionalität zu sein schien.
• Toxoplasma gondii is a globally distributed protozoan parasite with high zoonotic potential. In North America and Europe, three clonal Toxoplasma lineages have been established, type I, type II and type III. They differ in their virulence in laboratory mice: Type I Toxoplasma gondii is generally considered as highly virulent, whereas type II and III are less virulent in laboratory mice. In Germany, T. gondii type II prevails. Sexual recombinations among T. gondii are rarely found in Germany. Nevertheless, in a previous study recombinant T. gondii type II-III oocysts were isolated from the faeces of a naturally infected cat. In a further previous study the five tachyzoite clones B6-H6, 2-C10, 2-H8, C12, and A7 were generated from these oocysts by limiting dilution. These tachyzoite clones differed in the distribution of type II and III alleles. The aim of this doctoral thesis was to compare the five clones regarding their genotypes and phenotypes. A special focus was given on the well described polymorphic virulence factors ROP18, ROP5, ROP16 and GRA15, which can significantly affect differences in virulence in laboratory mice between the three clonal lineages. ROP18 and ROP5 are involved in the inhibition of IRG-mediated destruction of the parasitophorous vacuole, the major defense mechanism in mice against T. gondii. While all five clones possessed the virulent allele of ROP5, only two of the five clones, B6-H6 and 2-C10, had the virulent allele of ROP18, whose virulent genotype results in high expression. These two clones also caused 100 % mortality in the infected BALB/c mice. Here, the virulent ROP18 genotype was consistent with the high mouse virulence. The other three clones, 2-H8, C12 and A7, possessed the non-virulent allele of ROP18. However, of the latter three clones, only C12 and A7 elicited a lower, 30 % mortality in infected BALB/c mice. Here, the non-virulent ROP18 genotype would explain the lower virulence. Clone 2-H8, which also had a non-virulent ROP18 allele, on the other hand caused 100 % mortality. Thus, the virulence of the infected BALB/c mice could only be explained in four of the five clones with the ROP18 genotype in this study. In addition to ROP5 and ROP18, the virulence factors ROP16 and GRA15 were also investigated. They regulate the cytokine profile in infected macrophages and can thereby influence the clinical outcome of the infection. Each of the five clones had the virulent allele of ROP16 and GRA15. Therefore, the genotype of these virulence factors alone could not explain the differences in BALB/c mouse virulence. Also the expression profile of the virulence factors in in vitro inoculated J-774A.1 macrophages could not explain the differences in the mouse virulence. There were just observed slightly differences which did not seem to be biologically relevant. An in vitro inoculation of J-774A.1 macrophages with the clones further revealed that the intermediate virulent clone C12 was able to infect the macrophages much earlier and elicit higher IL-12 expression. In surviving BALB/c mice it caused a less extensive weight loss in contrast to the other clones. For this doctoral thesis it can be concluded that the virulence of the clones in laboratory mice cannot be explained solely by the presence of virulence-mediating ROP18 or other virulence genes. Due to the sexual recombination of T. gondii type II and III allelic combinations emerged in the offspring. With this a complex network of virulence associated factors seemed to be responsible for the differences in mouse virulence and macrophage function.