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The role of the immunoproteasome during Toxoplasma gondii infection and the characterization of SHP2D61Y gain-of-function mutation in T cells

  • The proteasome is a major part of the ubiquitin-proteasome-system playing an important role in cell homeostasis due to its protein quality control function. Moreover, the proteasome is involved in cell cycle regulation and in the regulation of transcription factors. Upon induction of interferons, or treatment with lipopolysaccharides, an isoform of the standard-proteasome is composed, named immunoproteasome (i-proteasome). The i-proteasome is constitutively expressed in immune cells and deficiency of proteolytic subunits of this multiprotein complex has been associated with a poor outcome during infectious diseases. I-proteasome-deficiency has been shown to result in reduced MHC class I presentation. Using mice which are deficient for all three proteolytic active subunits LMP2, MECL-1 and LMP7, we could demonstrate that i-proteasome-deficiency lead to an altered recruitment of immune cells to the CNS when challenged with the intracellular parasite Toxoplasma gondii, resulting in increased frequencies of neutrophils and other cells of myeloid origin. The shift to reduced frequencies of CD45highCD11blow lymphocytes can be further explained by a decreased migratory capacity of i-proteasome-deficient CD8+ T cells. In contrast to previous studies using other pathogens, effector function of CD8+ as well as CD4+ T cells, measured by frequencies of IFNγ, TNF, IL-2 and granzyme B producing cells, were not impaired in these mice, whereas induction of CD4+ Tregs was strongly reduced. In addition, we found that parasite control was comparable to control mice and that i-proteasome deletion caused an overall pro-inflammatory cytokine milieu within the brain. Our results indicate that i-proteasome-deficiency lead to prolonged tissue inflammation during T. gondii infection which could be an explanation for the more severe course of disease observed in these mice. The Src homology domain containing phosphatase 2 (SHP2) is a tyrosine phosphatase modulating several signaling pathways and therefore has an influence in cell cycle, differentiation, proliferation and cell activation. However, SHP2 is assumed to play a negative role during T-cell activation as the phosphatase has been shown to inhibit T-cell receptor-induced signaling cascades. Although, various gain-of-function mutations in the SH2 or PTP domain of this phosphatase, such as D61Y, have been associated with myeloproliferative diseases such as juvenile myelomonocytic leukemia (JMML), effects of such mutations on T cells have not been addressed in scientific literature so far. Therefore, in the second part of this thesis we could demonstrate that D61Y mutation in the SH2 domain of SHP2 did not cause JMML pathology when only introduced into T cells. Especially in aged mice, T cells of SHP2 mutant mice showed an increased expression of cell adhesion molecule CD44. In accordance with these findings, we observed increased influenza A virus-specific T cells in the bone marrow of SHP2 D61Y mutant mice, indicating a role of the phosphatase in memory formation or maintenance of CD8+ Tem. Although SHP2D61Y mice revealed a comparable viral clearance, IFNγ production of virus experienced CD4+ and CD8+ T cells was diminished compared to control mice, underlining a negative involvement of the phosphatase in the JAK/STAT1 signaling axis as suggested before by studies using mice with SHP2-/- T cells.
  • Das Proteasom ist ein wichtiger Bestandteil des Ubiquitin-Proteasom-Systems, zuständig für die Kontrolle des zellulären Protein-Pools und damit unabdingbar für die Zellhomöostase. Des Weiteren konnte eine wesentliche Beteiligung des Ubiquitin-Proteasom-Systems innerhalb des NF-κB Signalwegs nachgewiesen werden z.B. durch den Abbau des NF-κB Inhibitors IκBα. Induziert durch Interferone oder Lipopolysaccharide wird eine Isoform des Standard-Proteasom synthetisiert, das Immunoproteasom (I-Proteasom). In vorherigen Studien konnte gezeigt werden, dass die Deletion des I-Proteasom, welches insbesondere von hämatopoetischen Immunzellen konstitutiv exprimiert wird, während einer Infektion mit einem kritischeren Krankheitsverlauf einhergeht. Die Deletion des I-Proteasom ist assoziiert mit reduzierter MHC Klasse-I Antigenpräsentation. Anhand von Mäusen, die keine der drei proteolytischen Untereinheiten, also weder MECL-1, noch LMP2, oder LMP7 exprimieren (TKO Mäuse), konnten wir zeigen, dass eine I-Proteasom Defizienz während einer Infektion mit dem intrazellulären Parasiten Toxoplasma gondii mit einer veränderten Immunzellrekrutierung in das zentrale Nervensystem einhergeht. Die beobachtete reduzierte Rekrutierung von Lymphozyten konnte teilweise auf eine ebenfalls reduzierte Migrationsfähigkeit von I-Proteasom-defizienten CD8+ T-Zellen zurückgeführt werden. Im Gegensatz zu vorherigen Studien mit anderen Pathogenen konnten wir keine reduzierte T-Zell Aktivierung in unserem Mausmodel nachweisen, die Synthese von pro-inflammatorischen Zytokinen wie z.B. IFNγ, TNF oder IL-2 war, sowohl in CD4+ als auch in CD8+ T-Zellen, vergleichbar. Hingegen war die Induktion von regulatorischen T-Zellen in TKO Mäusen stark gehemmt. Obwohl TKO Mäuse keine Einschränkungen in der Kontrolle des Parasitenwachstums bzw. dessen Beseitigung aufwiesen, führte Die Deletion des I-Proteasom zu einem anhaltenden, globalen pro-inflammatorischen Milieu innerhalb des Gehirnparenchyms. Diese Befunde suggerieren, dass eine Defizienz von I-Proteasomen mit einer dauerhaften Gewebsentzündung und damit verbunden mit einer erhöhten neuronalen Schädigung einhergehen könnten, was schließlich den Krankheitsverlauf negativ beeinflusst. Die Src homology domain containing phosphatase 2 (SHP2) ist eine Tyrosin-Phosphatase die verschiedene Signalwege beeinflusst und dadurch Auswirkungen auf den Zellzyklus, auf die Proliferation, Differenzierung und die Zellaktivierung hat. In der T-Zell Aktivierung wird SHP2 jedoch eine negative Rolle zugeschrieben, da die Phosphatase die T-Zell-Rezeptor induzierte Signaltransduktion hemmt. Gain-of-function Mutationen, wie z.B. D61Y, in der SH2 oder PTP Domäne dieser Phosphatase sind hingegen assoziiert mit myeloproliferativen Neoplasien wie der Juvenilen Myelomonozytäre Leukämie (JMML). Wie sich diese Mutation auf T-Zellen auswirkt wurde in der bisherigen Fachliteratur nicht adressiert. Ziel des zweiten Teils dieser Arbeit war daher die Beschreibung der SHPD61Y Mutation in T-Zellen. Wir konnten zeigen, dass die gain-of-function Mutation in T-Zellen allein keine JMML-ähnlichen Pathologien hervorruft. Insbesondere bei älteren Mäusen konnte eine erhöhte Expression des Adhäsionsmoleküls CD44 in T-Zellen mit SHP2 D61Y Mutation beobachtet werden. Damit übereinstimmend konnte im Knochenmark von SHP2D61Y Mäusen nach Infektion mit Influenza-A-Virus (IAV) eine erhöhte Anzahl an Virus-spezifischen Effektor Gedächtniszellen nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse weisen auf eine Rolle von SHP2 bei der Generierung insbesondere von CD8+ T-Gedächtniszellen oder auf deren Überleben hin. Obwohl SHP2D61Y Mäuse während einer IAV Infektion verglichen mit Kontrollmäusen einen ähnlichen Krankheitsverlauf mit ähnlicher Virusbeseitigung aufwiesen, war die IFNγ Synthese in ex vivo stimulierten CD4+ und CD8+ T-Zellen deutlich reduziert. Dies weist auf eine negative Beteiligung von SHP2 im JAK/STAT1 Signalweg in T-Zellen hin, was Beobachtungen vorheriger Studien untermauert, bei denen eine Beteiligung von SHP2 am JAK-STAT1 Signalweg anhand SHP2-defizienter T-Zellen nachgewiesen werden konnte.

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Metadaten
Author: Nicole Israel
URN:urn:nbn:de:gbv:9-opus-36013
Title Additional (German):Die Rolle des Immunproteasomes während einer Toxoplasma gondii Infektion und die Charakterisierung der SHP2D61Y Gain-of-Function-Mutation in T-Zellen
Referee:Prof. Dr. rer. nat. Katharina Riedel, Prof. Dr. med. Ulrike Seifert, Prof. Dr. biol. hum. Luca Simeoni
Advisor:Prof. Dr. rer. nat. Katharina Riedel, Prof. Dr. med. Ulrike Seifert
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Year of Completion:2019
Date of first Publication:2020/03/11
Granting Institution:Universität Greifswald, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Date of final exam:2019/10/07
Release Date:2020/03/11
Tag:CD44, D61Y mutation, Immunoproteasome, LMP2, LMP7, MECL-1, Memory T cell, SHP2
GND Keyword:Gedächtniszelle, Neuroimmunologie, Proteasom, T-Lymphozyt, Toxoplasma gondii
Pagenumber:144
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Abteilung für Mikrobiologie und Molekularbiologie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie