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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002944-7

Proteom- und Transkriptom-Analysen zur Bestimmung der Immuntoxizität ausgewählter Naturstoffe

  • Der Einsatz von Tierversuchen in Forschung und Entwicklung nimmt trotz fortschreitender Optimierung von Testmethoden und –verfahren weiter zu. Zeitgleich werden fortwährend neue Substanzen isoliert oder synthetisiert, deren Wirkungen auf den humanen Organismus und speziell das Immunsystem nicht bekannt sind. In vitro Methoden stellen deshalb sowohl eine günstige und schnelle als auch eine ethisch unbedenkliche Alternative zu Tierversuchen dar. In der vorliegenden Arbeit sollten proteom- und transkriptombasierte Methoden dazu dienen, immuntoxische Eigenschaften von Naturstoffen zu identifizieren und diese Verfahren als Alternative zu Tierversuchen zu etablieren. Dazu wurden zwei humane Immunzelllinien mit Naturstoffen behandelt und das intrazelluläre Proteom sowie das Transkriptom spezifischer Biomarker-Gene analysiert. Zusätzlich dienten weitere Methoden wie Metaboliten-, Zellzyklus- und Apoptoseanalysen sowie die Identifizierung intrazellulärer reaktiver Sauerstoffspezies dazu, Ergebnisse zu verifizieren oder zusätzliche Informationen zu erhalten. Wie zu erwarten war, zeigten die Proteomanalysen, dass sowohl immuntoxische als auch nicht-immuntoxische Substanzen eine breite Wirkung auf das intrazelluläre Proteom haben. Vor allem Proteine, die in den allgemeinen Metabolismus, zelluläre Prozesse und Prozesse der Informationsverarbeitung involviert sind, wurden durch die Behandlung mit den Substanzen in ihrer relativen Menge auf den 2D-Gelen verändert. Allein durch die Zuordnung von Proteinen zu Stoffwechselwegen war eine Abgrenzung immuntoxischer und nicht immuntoxischer Substanzen nicht möglich. Dennoch gibt die Methode einen Einblick in die Wirkungsweise der Substanzen, wodurch Wirkmechanismen entschlüsselt und Reaktionen auf das Immunsystem abgeleitet werden können. Dies wird vor allem nach der Behandlung der Zellen mit Tulipalin A und Helenalin deutlich, da auch allgemeine Stoffwechselwege wie die Purinsynthese und die anaerobe Glykolyse einen Einfluss auf das Immunsystem haben. Zusätzlich zu den allgemeinen Stoffwechselwegen wurden einzelne Proteine in ihrer Abundanz verändert, die in Reaktionen des Immunsystems wie der Zytokinbildung oder der Bildung von MHC-Molekülen involviert sind. Außerdem konnten Biomarker für Immuntoxizität auf Proteomebene entwickelt werden. Mit Hilfe dieser Daten war eine Klassifizierung der Substanzen nach ihrer Immuntoxizität möglich. Anhand dieser Analysen wurden die Testsubstanzen Tulipalin A, Helenalin, Vincristin und Cannabidiol als immuntoxisch klassifiziert. Die Klassifizierung der Substanzen als immuntoxisch aufgrund der Biomarker-Proteine und Stoffwechselwege konnte durch die Anwendung von Transkriptom-Biomarkern bestätigt werden. Neben den über 2D-Gelelektrophorese-basierten Proteomanalysen getesteten Substanzen wurden auch Bisphenol A und Ergosterolperoxid aufgrund der Transkriptombiomarker als immuntoxisch klassifiziert. Agaritin und p-Tolylhydrazin sowie der Bisphenol A bis(2,3-dihydroxypropyl) ether haben keine immuntoxische Wirkung. Neben den Proteom-basierten Methoden dient der entwickelte Entscheidungsbaum basierend auf verschiedenen Methoden als Grundlage für die Immuntoxiztätsklassifizierung. Mit dem erstellten Entscheidungsbaum konnten beispielsweise Cyclosporin A, Helenalin und Tulipalin A durch die Anwendung gezielter Tests als immuntoxisch eingestuft werden, während Mannitol als nicht-immuntoxisch bestätigt wurde. Zusammenfassend war es mittels in vitro Methoden möglich, die Immuntoxizität verschiedener Naturstoffe zu identifizieren. Neben Proteom-basierten Methoden wurden auch Transkriptom- sowie funktionelle und Metabolomanalysen genutzt. Eine Validierung der Ergebnisse mit weiteren bekannten immuntoxischen und nicht-immuntoxischen Substanzen würde eine Anwendung als Alternative zu Tierversuchen für eine erstes Screening Testung neuer Substanzen ermöglichen und so sowohl Zeit und Kosten sparen als auch ethische Bedenken minimieren.
  • The application of animal experiments in research and development is rising despite proceeding improvement of test methods. Simultaneously, new substances with unknown effects to the human organism and immune system are isolated or synthesized. Therefore, in vitro methods provide a favorable and fast as well as ethically accepted alternative for animal experiments. In the present study, proteome as well as transcriptome based analyses were established to identify immunotoxic properties of natural substances. Two human immune cell lines were treated with natural compounds and afterwards, the intracellular proteome and transcriptome were analyzed. In addition, cell cycle, apoptosis and metabolite analyses were conducted to gain additional information. As expected, the proteome showed reactions to immunotoxic as well as non-immunotoxic substances. Especially the relative quantity of proteins involved in metabolism, cellular processes and genetic information processing was affected. However, the classification of these proteins was not sufficient to distinguish between immunotoxic and non-immunotoxic substances. Nevertheless, the proteome analysis enables an identification of modes of action as seen for the test substances tulipalin A and helenalin that affected the purine synthesis and the anaerobic glycolysis, respectively. These reactions can have an influence on the immune system. Additionally, some proteins were identified with changed relative quantity on the gel images that participate in reactions of the immune system as cytokine secretion of processing of MHC molecules. Furthermore, potential biomarker proteins could be identified. With the help of these analyses, the test substances tulipalin A, helenalin, vincristin and cannabidiol were identified as immunotoxic. This classification could be confirmed an transcriptome analysis of specific biomarker genes. Furthermore, bisphenol A and ergosterole peroxide were identified as immunotoxic. Agaritin, p-tolyle hydrazine and bisphenol A bis(2,3-dihydroxypropyl) ether are not immunotoxic. Next to the proteome analysis the developed decision tree based on different methods can be used for the identification of immunotoxic properties. With this decision tree, cyclosporin A, helenalin and tulipalin A were classified as immunotoxic whereas mannitol is not immunotoxic. In conclusion, with the help of in vitro methods the immunotoxicity of natural substances could be identified. Next to proteome analysis metabolome and functional analyses were used. A validation of the test methods with further known immunotoxic and non-immunotoxic substances is necessary to provide an alternative method for animal experiments.

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Metadaten
Author: Paula Zwicker
URN:urn:nbn:de:gbv:9-002944-7
Title Additional (English):Proteome and transcriptome analysis for the determination of the immunotoxicity of selected natural compounds
Advisor:Dr. Beate Haertel, Dr. Gerhild Wachlin, Prof. Dr. Ulrike Lindequist
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2017/12/08
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2017/11/17
Release Date:2017/12/08
Tag:Immuntoxizität, Jurkat, THP-1
GND Keyword:Proteom, Toxizität, Transkriptom, Zellkultur
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Pharmazie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 540 Chemie
MSC-Classification:92-XX BIOLOGY AND OTHER NATURAL SCIENCES / 92Cxx Physiological, cellular and medical topics / 92C37 Cell biology