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Thanh-Trung Nguyen

• Bacillus licheniformis is one of the most important hosts used in the biotechnological industry for the production of technical enzymes, antibiotics and a number of biochemicals. Although this bacterium has been used for a long time as an expression host, only little information on expression systems of this host is available. An expression system could be controlled by a cell density signal, a specific chemical inducer or a thermal shift. A limiting substrate such as glucose or phosphate limitation is suggested to use as the signal for the induction of an expression system. When B. licheniformis cells are subjected to nutrient limitation conditions, numerous genes involved in the metabolism of alternative nutrient sources are induced in order to keep cell survival. Therefore, the main topic of this study was to identify and investigate the regulation of genes or operons which are strongly induced in B. licheniformis cells grown under nutrient limitation conditions in order to apply for the construction of potential new expression systems. The research includes studies on the regulation of genes which are responsible for the acetoin and 2,3-butanediol utilization in B. licheniformis cells grown under glucose limitation conditions. Furthermore, we also analyzed the regulation of phytase gene expression as well as investigated the function of a putative ribonuclease expressed in B. licheniformis under phosphate limitation conditions. From this study, it was shown that in B. licheniformis, the utilization of acetoin and 2,3-butanediol was mainly mediated by enzymes encoded by the acoABCL operon. The transcription of this operon was regulated by sigma L transcription factor and was induced by acetoin. The acuABC operon was suggested to play as an indirect regulatory role for the acetoin utilization in B. licheniformis. This operon was controlled by a typical sigma A dependent promoter, however, acetoin was not an inducer for its expression. Furthermore, the regulation of phytase gene expression was suggested to be controlled by PhoPR-two component systems. The results showed that phytate, which is the substrate of phytase enzyme, was not an inducer for the expression of phy gene. However, growth experiments revealed that phytate served as a good alternative phosphate source for the growth of B. licheniformis cells under these conditions. Finally, the inactivation of BLi03719 gene, coding for a putative ribonuclease, resulted in an increase of the total RNA concentration of B. licheniformis cells grown in phosphate limited medium. However, the mutation did not affect the expression of the heterologous reporter gene. Therefore, it could be speculated that the putative ribonuclease BLi03719 plays a role in ribosomal RNA degradation under these conditions.
• Bacillus licheniformis ist einer der wichtigsten Wirte, die in der biotechnologischen Industrie zur Produktion von technischen Enzymen, Antibiotika und einer Vielzahl an Biochemikalien genutzt wird. Obwohl dieses Bakterium seit langer Zeit als Expressionswirt genutzt wird, sind nur wenige Informationen über die Expressionssysteme von diesem Wirt verfügbar. Ein Expressionssystem könnte durch ein Zelldichte-Signal, einen spezifischen chemischen Induktor oder durch einen Temperaturwechsel kontrolliert werden. Es liegt nahe, dass ein limitiertes Substrat, wie zum Beispiel bei der Glukose- oder Phosphatlimitierung, als Signal zur Induktion eines Expressionssystemes genutzt wird. Wenn B. licheniformis-Zellen Nährstoff-Limitationsbedingungen ausgesetzt sind, werden zahlreiche Gene, die in den Metabolismus alternativer Nährstoffquellen involviert sind, induziert, um die Zelle am Leben zu erhalten. Deshalb war es die Hauptaufgabe dieser Arbeit, Gene und Operons zu identifizieren und zu untersuchen, die in B. licheniformis Zellen, die unter Nährstoff-Limitationsbedingungen gewachsen sind, stark induziert werden. Die erhaltenen Informationen könnten dann zur Konstruktion neuer, potentieller Expressionssysteme genutzt werden. Die Arbeit beinhaltet Untersuchungen bzgl. der Regulierung von Genen, die für die Acetoin- und 2,3-Butandiol-Verwertung in B. licheniformis-Zellen verantwortlich sind, wenn diese unter Glukose-Limitationsbedingungen wachsen. Desweiteren analysierten wir auch die Regulation der Phytase-Gen-Expression und untersuchten die Funktion einer putativen Ribonuklease, die in B. licheniformis unter Phosphat-Limitierung exprimiert wird. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass in B. licheniformis die Nutzung von Acetoin und 2,3-Butandiol hauptsächlich durch Enzyme vermittelt wird, die vom acoABCL-Operon kodiert werden. Die Transkription dieses Operons wurde durch den SigmaL-Transkriptionsfaktor reguliert und durch Acetoin induziert. Es gibt Hinweise, dass das acuABC-Operon eine indirekte regulatorische Rolle bei der Acetoin-Nutzung in B. licheniformis spielt. Dieses Operon wurde durch einen typischen SigmaA-abhängigen Promotor kontrolliert. Acetoin war jedoch kein Induktor für dessen Expression. Desweiteren wurde vermutet, dass die Regulierung der Phytase-Genexpression durch PhoPR, einem zwei-Komponenten-System, kontrolliert wird. Die Ergebnisse zeigten, dass Phytat, das ein Substrat des Phytase-Enzyms ist, kein Induktor für die Expression des phy-Gens darstellt. Jedoch ergaben Wachstumsversuche, dass Phytat als gute alternative Phosphatquelle für das Wachstum von B. licheniformis-Zellen unter diesen Bedingungen diente. Schließlich resultierte die Inaktivierung des BLi03719-Gens, das für eine putative Ribonuklease kodiert, in einem Anstieg der Konzentration der Gesamt-RNA von B. licheniformis-Zellen, die in Phosphat-limitiertem Medium gewachsen waren. Allerdings hatte die Mutation keinen Einfluss auf die Expression des heterologen Reportergens. Daher kann vermutet werden, dass unter diesen Bedingungen die putative Ribonuklease BLi03719 eine Rolle in der Degradierung der ribosomalen RNA spielt.