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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-000899-7

Characterizing the Interaction of the Pathogen Staphylococcus aureus with its Human Host by Transcriptomic and Proteomic Approaches

  • Staphylococcus aureus is a commensal colonizing 20-30% of the population as well as a pathogen causing diverse diseases ranging from skin infections via toxin mediated diseases to life threatening conditions. In its interplay with the human host, this microorganism resorts to an extensive repertoire of both membrane-bound and secreted virulence factors facilitating adhesion to, invasion of, and spreading into various host tissues. Among the numerous virulence factors produced by S. aureus are the staphylococcal superantigens (SAgs). They directly cross-link conserved regions of the T cell-receptor with MHC class II molecules (outside the peptide-binding cleft) on antigen presenting cells. This results in a strong stimulation of up to 20% of all T cells which respond with proliferation and massive cytokine release. Recently, the enterotoxin gene cluster (egc) located on a pathogenicity island was described. The egc-genes are the most prevalent SAg genes in commensal and invasive S. aureus isolates. However, they appear to cause toxic shock only very rarely and their presence is negatively correlated with severity of S. aureus sepsis. Therefore it was suggested that SAgs might differ in their pro-inflammatory potential. In addition to their superantigenicity, SAgs also act as conventional antigens and induce a specific antibody response. In contrast to non-egc SAgs, despite the high prevalence of egc SAgs, neutralizing antibodies against egc SAgs are very rare, even among carriers of egc-positive S. aureus strains. In order to find an explanation for this “egc-gap”, we have tested two non-exclusive hypotheses: (i) egc and non-egc SAgs have unique intrinsic properties and drive the immune response into different directions and (ii) egc and non-egc SAgs are released by S. aureus under different conditions, which shape the immune response to them. To test these hypotheses, we compared the effects of egc and non-egc SAgs on human blood cells. Their T cell-mitogenic potencies, the elicited cytokine profiles as well as their impact on gene expression were highly similar. Both egc and non-egc SAgs induced a very strong pro-inflammatory response. In contrast, the regulation of SAg release by S. aureus differed markedly between egc and non-egc SAgs. Egc-encoded proteins were secreted by S. aureus during exponential growth, while non-egc SAgs were released in the stationary phase. We conclude that the distinct biological behavior of egc and non-egc SAgs is not due to their intrinsic properties, which are very similar, but is caused by their differential release by S. aureus. Traditionally, S. aureus has not been considered as an intracellular pathogen but strong evidence emerged indicating that staphylococci can invade and persist in various cell types. Internalization might constitute a bacterial strategy to evade the host’s defense reactions and the action of antibiotics. The intracellular niche might thus constitute a reservoir for chronic or relapsing infections. Contrary to their potential importance, genome-wide functional genomics analyses of the adaptation reactions of S. aureus to the host cell environment are rare and so far confined to gene expression profiling. Investigations addressing the proteome of internalized S. aureus are still lacking due to the challenge of obtaining a sufficient number of infecting bacteria. The proteome of other pathogens such as Francisella tularensis has been characterized by classical 2-DE approaches. However, the number of bacteria required for such a 2-DE based approach is often exceeding the numbers available from in vivo infection models. Furthermore, this approach does not allow monitoring of time-dependent quantitative changes in protein levels. Here, a workflow allowing time-resolved analysis of internalized S. aureus by combining pulse-chase stable isotope labeling by amino acids in cell culture with high capacity cell sorting, on-membrane digestion, and high-sensitivity mass spectrometry is presented. This workflow permits detection and quantitative monitoring of several hundred staphylococcal proteins from as little as a few million internalized S. aureus cells. This approach has been used to reveal time-resolved changes in levels of proteins in S. aureus RN1HG upon internalization by human bronchial epithelial cells. Proteins involved in stress adaptation as well as protein folding and some components of the phosphotransferase system were upregulated in internalized staphylococci, whereas proteins of the purine biosynthesis pathway and tRNA aminoacylation were downregulated. Furthermore, regulatory adaptive responses of internalized S. aureus to the intracellular milieu were shown as global regulators displayed increased protein abundance levels compared to non-internalized bacteria. Taken together, we observed changes in levels of proteins with functions in protection against oxidative damage and adaptation of cell wall synthesis in internalized S. aureus.
  • Staphylococcus aureus ist sowohl Kommensale, der dauerhaft 20-30% der gesunden Bevölkerung besiedelt, als auch Ursache verschiedenster Krankheiten. Für die Pathogenität von S. aureus ist ein umfangreiches Repertoire an Virulenzfaktoren verantwortlich. Unter den zahlreichen Virulenzfaktoren von S. aureus befinden sich auch die Superantigene (SAgs). Diese Toxine aktivieren bis zu 20% aller T-Zellen, indem sie gleichzeitig an den T-Zell-Rezeptor und an Klasse-II-MHC-Moleküle Antigen-präsentierender Zellen binden. Aktivierte T-Zellen reagieren mit starker Proliferation und schütten eine Reihe pro-inflammatorischer Zytokine aus. Kürzlich wurde eine Gruppe von SAgs entdeckt, die im „enterotoxin gene cluster“ (egc) kodiert sind. Diese egc-SAg-Gene sind die häufigsten in kommensalen und invasiven S. aureus-Isolaten. Trotzdem scheinen diese Isolate nur selten einen toxischen Schock auszulösen und von solchen Isolaten verursachte Sepsen zeigen weniger schwere Verläufe. Neben ihrer Superantigenität wirken SAgs auch als konventionelle Antigene und können daher eine spezifische Antikörperantwort auslösen. Trotz der hohen Prävalenz von egc-SAg-positiven S. aureus-Stämmen sind neutralisierende Antikörper gegen diese SAgs jedoch sehr selten, sogar in mit egc-positiven S. aureus-Stämmen besiedelten Individuen. Zur Erklärung dieser „egc-Lücke“ wurden zwei Hypothesen untersucht: (i) Egc- und nicht-egc-SAgs haben unterschiedliche intrinsische Eigenschaften und lösen unterschiedliche Reaktionen des Immunsystems aus und (ii) egc- und nicht-egc-SAgs werden von S. aureus unter verschiedenen Bedingungen sezerniert. Daher haben wir die Effekte von egc- und nicht-egc-SAgs auf humane Immunzellen getestet. Es stellte sich heraus, dass beide Gruppen sehr ähnliche T-Zell-aktivierende Eigenschaften besitzen. Es konnten keine Unterschiede hinsichtlich T-Zell-Proliferation, Zytokinsekretion und Genexpression gefunden werden. Die SAgs beider Gruppen induzierten starke pro-inflammatorische Immunantworten. Im Gegensatz dazu zeigte sich, dass die Verfügbarkeit von egc- und nicht-egc-SAgs im Überstand kultivierter Staphylokokken unterschiedlich reguliert wurde. Egc-SAgs konnten bereits während des exponentiellen Wachstums gefunden werden, wohingegen nicht-egc-SAgs erst in der stationären Wachstumsphase sezerniert wurden. Daraus lässt sich folgern, dass die adaptive Immunantwort nicht durch intrinsischen Eigenschaften von egc- und nicht-egc-SAgs, die sehr ähnlich sind, sondern durch die unterschiedliche Regulation von egc- und nicht-egc-SAgs beeinflusst wird. Ungeachtet seiner Fähigkeit, in verschiedensten Geweben zu persistieren und zu überleben, wurde S. aureus traditionell als extrazelluläres Bakterium angesehen. Allerdings zeigen Studien in verschiedenen Zellkulturmodellen, dass Staphylokokken in Zellen invadieren und darin überleben können. Hierbei könnte der Internalisierungsmechanismus eine potentielle Überlebensstrategie des Bakteriums darstellen, um dem wirtseigenen Immunsystem zu entgehen. Trotz ihrer möglichen Bedeutung für die Pathogenität von S. aureus wurden post-invasive Vorgänge aufgrund der erschwerten Isolation intrazellulärer Bakterien aus den Wirtszellen bisher nur in geringem Umfang untersucht. Die vorhandenen Studien beschränken sich weitgehend auf Genexpressionsanalysen. Proteomanalytische Untersuchungen internalisierter Bakterien sind nach wie vor selten. In der hier vorgestellten Studie gelang es erstmals, ein zeitaufgelöstes in vivo-Proteomprofil von internalisierten Staphylokokken vorzulegen. Dafür wurden Isotopen-markierte Bakterien in einem Pulse-Chase-Experiment von humanen Bronchialepithelzellen internalisiert. Das Proteom intrazellulärer Bakterien wurde nach verschiedenen Zeitpunkten unter Nutzung von Hochdurchsatz-Sortierung mittels Massenspektrometrie analysiert. Diese Methode ermöglichte, basierend auf nur wenigen Millionen sortierter Staphylokokken, die Identifikation von ca. 650 und die Quantifizierung von ca. 450 Proteinen sowie die Analyse quantitativer Veränderungen von Proteinen im S. aureus-Stamm RN1HG nach Internalisierung durch humane Wirtszellen. Erhöhte Level konnten beispielsweise für einige in der Stressadaptation relevante Proteine und das Chaperon PrsA gezeigt werden. Zudem wiesen einige Komponenten des Phosphotranserase-Systems eine erhöhte Abundanz in internalisierten Staphylokokken auf. Hingegen waren Proteine, die an der Purinbiosynthese und der Aminoacylierung von tRNAs beteiligt sind, in ihrer Abundanz reduziert. Weiterhin konnte auf adaptive Antworten internalisierter Staphylokokken auf das intrazelluläre Milieu geschlossen werden, da globale Transkriptionsregulatoren erhöhte Proteinlevels aufwiesen. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass in humane Bronchialepithelzellen invadierte Zellen des S. aureus-Stammes RN1HG Veränderungen in der Abundanz von Proteinen aufwiesen, die eine Rolle in der Abwehr von Schäden durch oxidativen Stress und in der Anpassung der Zellwandsynthese spielen.

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Metadaten
Author: Sandra Scharf
URN:urn:nbn:de:gbv:9-000899-7
Title Additional (German):Transkriptom- und Proteomanalytische Studien zur Interaktion des pathogenen Erregers Staphylococcus aureus mit seinem menschlichen Wirt
Advisor:Prof. Dr. Uwe Völker
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2011/01/13
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2010/12/10
Release Date:2011/01/13
Tag:Internalisierung, Pulse-Chase SILAC, Staphylococcus aureus, Wirts-Pathogen-Interaktion, in vivo Proteomics
Staphylococcus aureus, host-pathogen interaction, in vivo proteomics, internalization, pulse-chase SILAC
GND Keyword:In vivo, Internalisierung <Molekularbiologie>, Proteom, Staphylococcus aureus, Superantigen
Faculties:Universitätsmedizin / Arbeitsgruppe "Funktionelle Genomforschung"
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie