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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-000766-7

Thermodynamic and NMR Structural Studies on the DNA Binding of Bifunctional Drugs with Alkylating Activity

  • Pyrrolobenzodiazepines (PBDs) are a group of antitumor antibiotics that exert their biological activity by alkylation of guanine bases within the minor groove of double-stranded DNA through nucleophilic attack of the guanine amino group on the PBD imine functionality. In trying to increase both the binding strength and sequence selectivity for further enhancing their biological activity, PBDs were linked to additional DNA binding moieties. Preliminary DNA melting experiments partly also performed in our lab with a series of closely related PBD-naphthalimide and benzimidazole conjugates revealed extraordinary DNA-binding capability of hybrids PBD-NIM and PBD-BIMZ. These studies also indicated the favorable contribution of the piperazine structure on drug binding to the DNA duplex. Previously, in vitro cytotoxicity studies also showed promising antitumor activity of both compounds with PBD-BIMZ having the largest cytotoxic potential among various examined conjugates. In the present work, the kinetics, thermodynamics and structural details of the drug-DNA interactions have been determined employing a variety of spectroscopic, calorimetric and computational methods. Thus, a high thermal duplex stabilization upon DNA binding could be ascertained for both drugs and attributed to their covalent attachment to the DNA guanine bases. The 1:1 binding stoichiometry as well as the exclusive minor groove binding for the benzimidazole and the mixed minor grove - intercalative type of binding for the naphthalimide hybrid could be verified by several spectroscopic methods including NMR spectroscopy. Furthermore, by using a combination of solution NMR and some of the most recent molecular modeling techniques, the first high-resolution structures of DNA-drug complexes with PBD hybrid drugs could be obtained giving detailed insight into the specific drug-DNA interactions. Thus, details on van der Waals and hydrogen bond contacts within the complex and the tight fit of the benzimidazole hybrid into the DNA minor groove could be revealed. By using recent data analysis techniques like clustering algorithms, the high flexibility of the piperazine moiety within the PBD-BIMZ-DNA complex could be nicely captured and visualized. Additionally, a thermodynamic analysis for the non-covalent drug binding by UV and fluorescence spectroscopy as well as by direct calorimetric methods revealed a 1:1 binding mode driven by enthalpy changes and counteracted by unfavorable entropic contributions to result in moderately strong association constants. Analysis of the solvent-accessible surface area confirmed the importance of hydrophobic effects on drug binding and the combination of these data with ITC measurements allowed for an extensive thermodynamic characterization of the drug binding process. With respect to the influence of the individual drug moieties on DNA binding, the importance of the piperazine ring for drug-DNA interactions and the basis for its capability to enhance drug binding were addressed. Furthermore, it could be shown that the naphthalimide and benzimidazole moieties also impart additional sequence selectivity to the alkylating PBD structural unit and these distinct differences in the sequence selectivity could be linked to the three-dimensional structures of the DNA-drug complexes. Clearly, the combination of detailed structural and thermodynamic data of complex formation allows for a better understanding of the binding mechanism and structure-activity relationship when it comes to drug-DNA interactions. Therefore, the information gathered can assist in the design of more efficient derivatives of this type of alkylating DNA binding drugs in particular and of DNA recognition by ligands composed of several motifs in general.
  • Pyrrolobenzodiazepine (PBDs) sind zytotoxische Wirkstoffe mit antitumoraler und antibiotischer Aktivität. Sie verdanken diese biologischen Eigenschaften ihrer Fähigkeit, kovalent an Guaninbasen innerhalb der kleinen Furche von doppelsträngiger DNA anzubinden. Um sowohl die Sequenzselektivität und Affinität als auch die biologische Wirksamkeit weiter zu erhöhen, wurden PBDs mit weiteren DNA-bindenden Motiven verknüpft. Voruntersuchungen, die teilweise in unserem Labor durchgeführt wurden, zeigten, dass innerhalb einer Serie von verwandten PBD-Naphthalimid und PBD-Benzimidazol Konjugaten die Hybride PBD-NIM und PBD-BIMZ die vielversprechendsten DNA-Anbindungsfähigkeiten als auch Zytotoxizität besaßen. Außerdem stellte sich heraus, dass insbesondere die Piperazin-Ringe wesentlich zur Anbindung an doppelsträngiger DNA beitragen. In der vorliegenden Dissertation wurden die Kinetik, die Thermodynamik und auch die strukturellen Details der DNA-Wechselwirkungen beider Hybride untersucht. Es wurden dazu eine Vielzahl von spektroskopischen und kalorimetrischen Methoden und auch Computational Chemistry eingesetzt. Mit Hilfe dieser Methoden konnte die außergewöhnlich starke thermische Stabilisierung von doppelsträngiger DNA bei Wirkstoff-Zugabe auf die kovalente Anbindung beider Hybride zurückgeführt werden. Die 1:1 Bindungsstöchiometrie sowie die vollständige Anbindung von PBD-BIMZ in der kleinen Furche bzw. die von der kleinen Furche ausgehende Interkalation von PBD-NIM konnten mit spektroskopischen Methoden inklusive NMR aufgeklärt werden. Außerdem war es durch Kombination von NMR mit einigen der aktuellsten Molecular Modeling Methoden möglich, die ersten hochaufgelösten Strukturen beider DNA-Wirkstoff Komplexe und somit auch detaillierte Einsichten in deren DNA Interaktionen zu erhalten. Details der Wasserstoff-Brücken als auch der van der Waals Kontakte sowie die passgenaue Anbindung des PBD-BIMZ in der kleinen Furche konnten aufgeklärt werden. Durch die Verwendung modernster Datenanalyse-Techniken wie Clustering-Algorithmen konnte des Weiteren die hohe Flexibilität des Piperazin-Ringes innerhalb des PBD-BIMZ-DNA Komplexes eingefangen und visualisiert werden. Die thermodynamische Analyse des nicht-kovalenten Bindungsmodus durch UV- und Fluoreszenz-Titrationen sowie durch Kalorimetrie ergab einen enthalpisch getriebenen 1:1 Bindungsmodus mit unvorteilhafter Entropie und mäßig-starker Assoziationskonstante. Eine Analyse der lösungsmittelzugänglichen hydrophoben Oberflächen zeigte die Bedeutung des hydrophoben Effekts für die DNA-Anbindung und eine Kombination dieser Daten mit den ITC-Messungen ermöglichte die ausführliche thermodynamische Charakterisierung der DNA-Wirkstoff Interaktion. Es wurde außerdem der Einfluss der individuellen Wirkstoff-Motive auf die DNA-Anbindung untersucht. Dabei konnte der starke Einfluss des Piperazin-Ringes auf die DNA-Anbindung gezeigt und auch untersucht werden. Des Weiteren erhöhten die Naphthalimid- bzw. Benzimidazol-Motive die Sequenzselektivität der alkylierenden PBD-Einheit und die auftretenden Unterschiede bezüglich der Selektivität konnten mit den 3D-Strukturen der DNA-Wirkstoff Komplexe verknüpft werden. Die Kombination aus detaillierten strukturellen und thermodynamischen Daten der Komplex-Bildung ermöglicht sowohl ein besseres Verständnis des Bindungs-Mechanismus als auch der Struktur-Aktivitäts-Beziehung. Die gesammelten Informationen können daher genutzt werden, um noch effizientere Derivate speziell dieses Typs von alkylierenden Wirkstoffen herzustellen als auch ganz allgemein Wirkstoffe zu verbessern, die aus mehreren Motiven aufgebaut sind.

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Metadaten
Author: Michael Rettig
URN:urn:nbn:de:gbv:9-000766-7
Title Additional (English):Thermodynamic and NMR Structural Studies on the DNA Binding of Bifunctional Drugs with Alkylating Activity
Title Additional (German):Thermodynamische und NMR-strukturelle Untersuchungen zur DNA-Anbindung von bifunktionalen Wirkstoffen mit alkylierender Aktivität
Advisor:Prof. Dr. Klaus Weisz
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2010/03/15
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2010/03/03
Release Date:2010/03/15
Tag:DNA-Wirkstoff-Interaktion; DNA-Wirkstoff-Struktur; pyrrolobenzodiazepine
DNA-drug interaction; DNA-drug structure; pyrrolobenzodiazepine
GND Keyword:DNS, Arzneimitteldesign, Thermodynamik
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Chemie und Biochemie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 540 Chemie