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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002709-1

Entwicklung von Hairpinribozymvarianten zur ortsspezifischen RNA-Sequenzveränderung

  • Das Forschungsgebiet des RNA-Engineerings beschäftigt sich u.a. mit der Entwicklung von Ribozymen mit neuen oder verbesserten Eigenschaften. Es umfasst nicht nur den Entwurf neuer Ribozyme mittels in-vitro-Selektion oder rationalem Design, sondern auch die Validierung der entworfenen Systeme mit Hilfe von Aktivitätstests oder strukturellen Untersuchungen. In dieser Arbeit wurden mit Hilfe der Methoden des RNA-Engineerings verschiedene Hairpinribozymvarianten generiert werden, die eine ortsspezifische RNA-Sequenzveränderung innerhalb geeigneter RNA-Substrate erlauben. Dabei war sowohl die potenzielle Anwendung dieser Ribozyme in der molekularen Medizin als auch deren Rolle als RNA-Rekombinasen in einer möglichen RNA-Welt von Interesse. Der Schwerpunkt dieser Arbeit lag hierbei in der Entwicklung eines Reportersystems, welches den direkten Nachweis einer twinribozymvermittelten Reparaturreaktion in Zellen erlaubt. Das Reportersystem basiert auf der Reparatur einer Vierbasendeletion innerhalb der EGFP-mRNA. Durch rationales Design wurde ein Twinribozym generiert, das die Reparatur mit einer Reparaturproduktausbeute von 32 % katalysiert. Das erfolgreich entwickelte Reportersystem steht somit für Experimente unter Zellkulturbedingungen zur Verfügung und eröffnet außerdem den Weg, die Twinribozymstrategie in der Zelle zu adaptieren und zu optimieren, um sie später intrazellulär für gewünschte Ziel-RNAs anwenden zu können. Ausgehend von der den Twinribozymen eigenen Aktivität zur Katalyse eines RNA-Fragmentaustauschs wurde darüber hinaus im Kontext der RNA-Welt-Hypothese ein Hairpinribozym entwickelt, welches durch Rekombination zweier nicht-funktioneller RNA-Substrate ein funktionelles RNA-Molekül generiert. Hierbei führte die hairpinribozymvermittelte Spaltung zweier geeigneter Substrate, Rekombination der Spaltfragmente und Ligation der neuangeordneten Fragmente mit einer Rekombinationsproduktausbeute von 76% zur Generierung eines funktionsfähigen Hammerheadribozyms.
  • RNA engineering is a research area that deals among others with the development of novel ribozymes or the equipping of known ribozymes with new or improved properties. Next to the design of new ribozymes by in vitro selection or rational design the engineering process includes also the validation of the developed systems by means of activity tests or structural studies. Based on the methods of RNA engineering the aim of this work was to design hairpin ribozyme variants that allow site-directed RNA sequence alterations within suitable RNA substrates. A potential therapeutical application of these ribozymes as well as their role in a possible RNA world was a major focus of this doctoral thesis. In this work a reporter system enabling the detection of a twin ribozyme-mediated repair reaction within cells has been successfully developed. The reporter system is based on the repair of a four base deletion within the EGFP mRNA. A twin ribozyme developed by rational design was able to catalyze the repair reaction gaining a repair product yield of 32 %. The successfully developed reporter system can now be used for experiments under cell culture conditions allowing both adaption and optimization of twin ribozyme-mediated RNA repair in cells to pave the way for a general intracellular application of this twin ribozyme strategy for the repair of desired target RNAs. Additionally, another ribozyme capable of catalyzing RNA sequence exchange has been developed that could have played an important role in a possible RNA world. Therefore a hairpin ribozyme has been designed, which is able to generate a RNA molecule with functional properties by catalyzing the recombination of two non-functional RNA substrates. The hairpin ribozyme-mediated cleavage of two suitable RNA substrates, recombination of the cleavage fragments and ligation of the newly arranged RNA fragments led to the generation of an active hammerhead ribozyme with a recombination product yield of 76 %.

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Metadaten
Author: Darko Balke
URN:urn:nbn:de:gbv:9-002709-1
Title Additional (English):Development of hairpin ribozyme variants for site-directed RNA sequence alteration
Advisor:Prof. Dr. Sabine Müller
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2017/02/15
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2017/01/25
Release Date:2017/02/15
Tag:RNA, RNA repair, recombination, ribozyme
GND Keyword:RNA, RNA-Reparatur, Rekombination, Ribozym
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Chemie und Biochemie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 540 Chemie