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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002093-5

RNA Funktionskontrolle durch strukturelles Design

  • Das Hairpin-Ribozym-basierte System CRZ-2 wurde verwendet, um Selbst-Prozessierungsprodukte nach Ribozym-Reaktion zu untersuchen. Inter- und intramolekulare Ribozym-Reaktionen sollten mit CRZ-2 und dem entsprechenden linearen 83mer (l-83mer) durchgeführt und Oligomere und zyklisierte RNAs nachgewiesen werden. Über die Bildung der intermediären Spaltprodukte und des finalen Spaltproduktes konnte der Ablauf der Spalt-Kaskade komplett gezeigt werden. Dies war insbesondere durch vergleichende Verwendung von Test-Systemen im denaturierenden Polyacrylamid-Gel möglich, da eines der Systeme eine eindeutige Separation der Produkte im Gel zulässt. Weiter konnten die zwei erwarteten Spalt-Produkte (83mer und 92mer) über Sequenzierung ihrer komplementären DNAs nachgewiesen werden. Um zwischen zyklischen und linearen Reaktionsprodukten unterscheiden zu können, wurden folgende Methoden herangezogen: i) 2D-PAGE ii) exonukleolytischer Abbau von RNA in Lösung und im Gel, iii) Vergleich des Laufverhaltens eines inaktiven RNA-Monomers mit dem Reaktionsgemisch des l-83mer nach Ligationsreaktion, iv) AFM und v) Ferguson-Plot. Es zeigte sich, dass das CRZ-2 nach Ribozym-Reaktion ausschließlich lineare Produkte und Oligomere bis zum Trimer hervorbringt, während das l-83mer nach Ligationsreaktion auch einen Ring, das zyklische 83mer, hervorbringt. Das Wissen um die Art der Reaktionsprodukte von CRZ-2 und dem l-83mer ermöglichten es, diese beiden RNAs als Referenz-Systeme zu benutzen, um Hairpin-Ribozym-basierte Varianten zu untersuchen. Die bioinformatische Entwicklung neuer Varianten erfolgte in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Ivo Hofacker (Universität Wien). Dabei wurde ein wahrscheinlichkeitsbasierter Entwurf (probability based design, kurz: PBD) für RNA-Sekundärstrukturen mittels Programm Switch.pl aus dem Vienna RNA package 2.0 verwendet. Die für die katalytische Aktivität der Hairpin-Ribozym-Varianten essentiellen Basenfolgen in den Loops wurden beibehalten. Alle Test-Systeme waren bistabil, denn sie zeigten indirekt, das die für CRZ-2 übliche Spalt-Kaskade durchlaufen wurde, indem das jeweilige zyklische 83mer über 2D-PAGE nachgewiesen wurde. Wie erwartet, waren die Varianten insgesamt aktiver als das Referenzsystem CRZ-2 und sie unterschieden sich, wie bioinformatisch charakterisiert, in ihrem Zirkularisationsverhalten bezüglich der Monomere. Bioinformatisch unerwartet war das Zyklisierungsverhalten der Dimere. Ausschließlich bei Test-System 4 könnten gemäß 2D-PAGE und AFM Analyse unter anderem auch dimere RNA-Ring entstanden sein. PBD4 ist das System, bei welchem die geringste Dimer-Zyklisierungstendenz angenommen wurde. Eine erste Evaluierung der PBD-Methode ergibt somit, dass die Erwartungen für die bioinformatische Charakterisierung des Ablaufs der Spalt-Kaskade bis zur Monomerzyklisierung erfüllt wurden. Für die bioinformatisch nicht vorausgesagten experimentellen Ergebnisse, z.B. bei der Dimerzyklisierung, könnten verstärkt tertiäre Interaktionen relevant sein, die mit der PBD-Methode zur Sekundärstrukturvorhersage nicht berücksichtigt werden. Sequenz-Alignments der Test-Systeme zu CRZ-2 ließen Rückschlüsse auf die Funktionen einzelner Basen zu. Vier Basen traten zusätzlich zu den vorgegebenen Sequenzen auf. Diese befinden sich in einer Helix und könnten kritisch für das Zustandekommen dieser Helix als wichtiges Strukturelement im bistabilen Ribozym sein. Dieser Aspekt könnte in weiterführenden Arbeiten mit rationalem Design z.B. über Einfach- oder Doppelmutation weiter untersucht und die Auswirkungen auf die Selbst-Prozessierungsereignisse analysiert werden. Interessant sind auch die eingeführten Mutationen im superstabilen Tetraloop der Hairpin-Ribozym-Varianten. Im Sequenz-Alignment zeigte sich, dass sich PBD3 und 4 nur um zwei sich im Tetraloop befindlichen Basen unterscheiden (Positionen 1 und 3). Da sich die beiden Systeme bezüglich ihrer Oligomerisierungs- und Zyklisierungstendenz unterscheiden, sind diese beiden Positionen für die Funktionen essentiell.
  • The hairpin ribozyme-based system CRZ-2 was used to investigate the self-processing products derived from ribozyme reaction. Inter- as well as intramolecular ribozyme reactions were performed with CRZ-2 and its linear 83mer (l-83mer), whereas oligomers and circularized RNAs were identified. Complete transition through the CRZ-2’s cleavage cascade was shown by the identification of intermediate and final cleavage products inter alia via Sanger sequencing of the corresponding complementary DNAs of the 83mer and the 92mer. Additionally, comparative polyacrylamide electrophoresis of test systems allowed to assign unambiguously the cleavage products of all systems in denatured gels. To distinguish between linear and circular products of ribozyme reactions several methods were combined: i) 2D-PAGE ii) assessment of exonucleolytic decay of RNA in solution and in gels, iii) comparison of the migration manner of an inactive RNA monomer with the reaction mixture of the l-83mer after ligation reaction iv) AFM and v) Ferguson-Plot. It became apparent that linear products such as oligomers up to trimers are exclusively derived from CRZ-2’s ribozyme reaction, while the l-83mer also forms RNA rings (the cyclic 83mer). The analyses of the reaction products of CRZ-2 and the l-83mer enabled their usage as reference systems for the investigation of hairpin ribozyme variants. The bioinformatic development of new CRZ-2 variants was performed in collaboration with the group of prof. Ivo Hofacker (University of Vienna) using a probability based design, short: PBD. The program Switch.pl from Vienna RNA package 2.0 was used to calculate the probability to form catalytically active secondary structures, resulting in hairpin ribozyme variants. The specific activity was ensured by keeping the essential bases of the loops while all other positions were freely exchangeable. All four test systems were bistable, displaying the cleavage cascade typical for CRZ-2. This was evaluated by identification of the cyclic 83mer by 2D-PAGE for all test systems. All CRZ-2 variants were more active than the reference system CRZ-2, and as bioinformatically proposed, they differ in their ability to form cyclic monomers. From a bioinformatic point of view the dimer circularization abilities of the test systems were unexpected. Test system four was the only variant that showed several RNA rings of different size, very likely also including cyclic dimers.PBD4 is the system which was meant to show the lowest ability to form cyclic dimers. A first evaluation of the probability based design reveals that bioinformatic expectations were fulfilled on a monomeric level from cleavage cascade to circularization of the 83mer. Bioinformatically non-expected experimental results may be caused by tertiary interactions that are not part of the PBD, dealing with predictions concerning secondary structures exclusively. Sequence alignments comparing test systems with CRZ-2 allowed for conclusions concerning the base functions. In addition to the essential bases which were not allowed to be changed in the PBD approach, four bases were found in all sequences. These four bases are present in helices, and may be essential for helix formation as an important structural motive in the bistable ribozyme. In future projects, this aspect can be further elucidated by single-or double mutations in the respective regions to assess their influence on self-processing events. The most interesting are the new bases introduced in the superstabile tetraloop of the hairpin ribozyme variants. Sequence alignment showed that PBD3 and 4 differ only by two bases and these are present in this tetraloop (positions 1 und 3). Since these two test systems also differ in their ability to form oligomers and RNA rings, it was concluded that these two positions are essential for programming ribozyme function towards circularization and/or oligomerisation.

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Metadaten
Author: Sonja Petkovic
URN:urn:nbn:de:gbv:9-002093-5
Title Additional (English):Control of RNA function by structural design
Advisor:Prof. Dr. Christian Hamman, Prof. Dr. Sabine Müller
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2014/12/03
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2014/07/01
Release Date:2014/12/03
Tag:Vorhersage
RNA, circular, ribozyme, secondary structure
GND Keyword:RNA, Ribozym, Sekundärstruktur, zirkular
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Chemie und Biochemie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 540 Chemie