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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-opus-21758

RNA virus detection and identification using techniques based on DNA hybridization

  • Humanity is constantly confronted with the emergence and reemergence of infectious diseases. Many of them produce large or devastating epidemics, like AIDS (HIV) and Ebola. Others have been long neglected, yet pose immediate threats to global public health as evidences the abrupt emergence of Zika virus in South America and its association with microcephaly in babies. The examples illustrate, that many of these diseases are provoked by RNA viruses. One of the first steps in understanding and eliminating those threats is the development of sensitive and rapid diagnostic methods. A general and relatively rapid method is the direct detection and examination of the agent’s genome. However, the nature of (re)emerging RNA viruses poses a series of very specific problems for the design of such methods. Therefore, a systematic approach was proposed for the design of DNA-hybridization-base methods to detect and characterize RNA viruses that will have both a high sensitivity and a specificity sufficiently broad to detect, per reaction, down to a single copy of any of the possible variants of the viral genome. Following this approach a series of assays were designed, developed or adapted and put into use for detection and characterization of important RNA viruses. One of those viruses is West Nile virus (WNV), which after its explosive introduction into USA become the most widespread flavivirus throughout the world and, consequently, many countries began an intensive monitoring. While existing assay detected predominantly the Lineage 1, in Europa Lineage 2 was expected. Two new RT-qPCR for the detection of both lineages were developed, and reportedly used by independent laboratories. Due to more than 50000 associated deaths per year, the Hepatitis E virus also received an increasing attention to elucidate novel routes of transmission. This virus (especially genotype 3) has the zoonotic potential of transmission from pigs and wild boar to humans. RT-qPCR and nested qPCR for detection and characterization of this virus as well as a methodology for subtyping were developed and the first detected case of subtype 3b in a German wild animal was documented. In addition a novel assay for flaviviruses conformed by a RT-qPCR coupled with a low density DNA microarray was developed, which enabled the identification of WNV in mosquitoes from Greece. A RT-qPCR suitable for surveillance and diagnostic of all known variants of Venezuelan equine encephalitis virus was developed too. A causative agent of hemorrhagic infections, the Ngari virus, was detected and characterized in animal samples from Mauritania. These achievements were supported by the development of software applications for selection and visualization of primers and probes from aligned DNA sequences and for modeling of DNA hybridizations using unaligned sequences. In conclusion a general methodology for rapid development of sensitive diagnostic methods based in DNA-hybridization technics (PCR, sequencing and microarray) was stablished and successful applications are reported.
  • Die Menschheit wird ständig durch das Auftreten neuer und neuartiger Infektionskrankheiten wie HIV (AIDS) und Ebolafieber bedroht, die große und verheerende Epidemien auslösen. Andere wurden lange vernachlässigt, doch stellen sie eine unmittelbare Bedrohung für die öffentliche Gesundheit weltweit dar, wie sie durch das Auftreten des Zika-Virus in Südamerika und seine Assoziation von Neugeborenen mit Mikrozephalie belegt wurde. Viele dieser Krankheiten werden durch RNA-Viren verursacht. Daher ist ein erster Schritt zur Beseitigung solcher Bedrohungen die Entwicklung von sensitiven und schnellen diagnostischen Methoden, wobei in der Regel ein Teil des Genoms direkt detektiert wird. Da die Eigenschaften der RNA-Viren für das Design entsprechender Methoden sehr spezifischen Probleme darstellen, wurde ein systematischer Ansatz mit DNA-Hybridisierungs-basierten Methoden gewählt, mit dem hochsensitiv alle Varianten des viralen Genoms detektieren werden können. Anhand dieses Ansatzes wurden Assays entwickelt oder angepasst und für den Nachweis und die Charakterisierung wichtiger RNA-Viren eingesetzt. Im Rahmen der Arbeit wurde eine RT-qPCR zum Nachweis des West-Nil-Virus (WNV) und seiner Linien 1 und 2 entwickelt. WNV ist weltweit verbreitet und kann beim Menschen zu schweren neurologischen Erkrankungen führen. Daneben wurden RT-qPCR Assays zur Diagnostik von Hepatitis-E-Viren (HEV) und aller Varianten der Venezolanische Pferde-Enzephalomyelitis (VEEV) entwickelt. Das HEV ist, mit weltweit mehr als 50000 Todesfällen im Jahr, der häufigste Erreger akuter Leberentzündungen. Das Virus, insbesondere der Genotyp 3, kommt auch in Deutschland vor, wobei als Hauptwirte Haus- und Wildschweine angesehen werden. Die Subtypisierung der HEV Genotypen 3 wurde aktualisiert und erstmals der Subtyp 3b in einem Wildtier in Europa dokumentiert. VEE ist eine tödlich verlaufende Viruskrankheit der Pferde, die auch auf den Menschen übertragen werden kann. Das Virus wird ebenfalls über Stechmücken übertragen und kommt bislang in Südamerika vor. Zudem konnte mit Hilfe einer RT-qPCR erstmals das Ngarivirus, ein hämorrhagisches Orthobunyavirus, in Ziegen in Mauretanien detektiert und charakterisiert werden. Schließlich wurde ein RT-qPCR Assay entwickelt, der - gekoppelt mit einem DNA-Microarray - Flaviviren spezifisch detektieren und erkennen kann. Mittels diese Assays konnten in Stechmückenproben aus Griechenland WNV der Linie 2 detektiert werden. Diese Ergebnisse wurden durch die Entwicklung von zwei Software-Tools unterstützt: Eines für Visualisierung von DNA-Sequenzalignments zur Selektion von Primern und Sonden und eines für die thermodynamische Modellierung von DNA-Hybridisierungen wobei keine Sequenzalignments notwendig sind. Zusammenfassend konnte mit Hilfe dieser Methodik eine schnelle Entwicklung von sensitiven diagnostischen Methoden, die auf DNA-Hybridisierungstechniken (PCR, Sequenzierung und Microarray) basieren, etabliert und in einer Reihe von Anwendungen erfolgreich eingesetzt werden.

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Metadaten
Author:Dr. rer. nat. Ariel Viña RodríguezORCiD
URN:urn:nbn:de:gbv:9-opus-21758
Title Additional (German):Nachweis und Identifizierung von RNA-Viren mittels DNA-Hybridisierungs-Techniken
Referee:Prof. Dr. Winfried Hinrichs, Prof. Dr. Reimar Johne
Advisor:Prof. Dr. Martin H. Groschup
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Year of Completion:2018
Date of first Publication:2018/05/17
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2018/04/19
Release Date:2018/05/17
Tag:DNA-microarray, Flavivirus, HEV, RT-qPCR, VEEV, WNV, genotyping, viral diagnosis
GND Keyword:Hepatitis-E-Virus , Polymerase-Kettenreaktion , Microarray , West-Nil-Virus , Flaviviren , RNS-Viren , Genotypisierung
Pagenumber:112
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Chemie und Biochemie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie