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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002977-4

The development of biosensors based on functional nucleic acids

  • The overarching goal of this work was to develop a biosensor based on functional nucleic acids. The biosensor should be modular, such that by exchange of the recognition unit, tailored biosensors could be created, allowing detecting a variety of analytes on demand. In the context of the cooperation with a company, initially, TNFalpha was chosen as an analyte. In a previous work, it was tried to build a modular aptazyme for TNFalpha that was based on four aptamers that were developed by SELEX. Here, these aptamers were investigated more closely by different methods (SPR, QCM). In the present work, it was proven beyond doubt that this attempt was not feasible. The aptamers were not able to bind the biologically active form of TNFalpha. An even more interesting finding was that a common tool to immobilize molecules to investigate their interactions with a binding partner, namely the streptavidin-biotin interaction, can strongly influence the result of the assay and causing false-positive results. Afterwards, it was decided to continue the work with a DNAzyme and modular approach was strictly refrained. It was tried to build aptazymes for TNFa or creatinine by in vitro selection, which failed. Most likely, the crucial factors were the ligands itself and the high demand on in vitro selection to select two functionalities (aptamer and catalytic activity) in parallel. This was the reason, to develop a new and a different method with streptavidin as a model analyte. The new strategy was to combine in vitro selection and rational design. The 17E-DNAzyme was chosen as catalytically active module. In preparation of the in vitro selection work, its properties were analyzed. An oligo-based inhibitor of the 17E-DNAzyme was rationally designed and its functionality was experimentally evaluated. Then, a library was designed which contained the 17E-DNAzyme, a randomized domain, and the inhibitor and its functionality was experimentally proven. The in vitro selection for the aptamer and the catalytic function were separated in two steps where the substrate strand was introduced in the second step. The knowledge about in vitro selection procedures, which was gained in the first trials with TNFalpha and creatinine was applied and could be substantially broadened. The crucial factors for the success of this process were identified. Most important steps are the amplification steps between the rounds and the in vitro selection pressure. The template concentration in the PCR has to be very low; the selection pressure has to be high. However, in fact, the exact quantity of "low" and "high" is difficult to determine exactly, it has to be individually evaluated for every amplification step, and this makes in vitro selection a method that requires a lot of experimental skills, optimization procedures, and experience. An EMSA was established and performed to qualitatively prove the affinity of the library for streptavidin in the first step of the in vitro selection method. For the second step, the in vitro selection of the catalytic function, considerable effort was done, but the in vitro selection did not succeed. Using the Biacore, the dissociation constant of the pool, which was applied in the second step of in vitro selection, was determined to be KD = 38 nM. This is very low, and by sequencing the pool it was found that the sequence variability was too low. The sequences share a cramp-like stem-loop structure, which hold the DNAzyme in an inactive conformation. This work presents valuable results for the development of biosensors based on nucleic acids, applying in vitro selection and rational design. Aptamers for streptavidin were selected. The library, which was used for this in vitro selection was structurally constrained. This obviously, represented an exceptionally good starting point for the in vitro selection. In this work, a lot of information about the development of in vitro selection systems was gained. Important work was done on establishing a click chemistry-based immobilization strategy. This work is going to fundamentally facilitate a new in vitro selection approach based on this immobilization strategy.
  • Das übergeordnete Ziel dieser Arbeit war es, einen Biosensor basierend auf Nukleinsäuren zu entwickeln. Dieser Biosensor sollte modular aufgebaut sein, so dass die Erkennungseinheit ausgetauscht werden könnte. Dieses Design sollte ermöglichen, nach Bedarf maßgeschneiderte Biosensoren für verschiedene Analyten zu entwickeln. Im Rahmen einer Industriekooperation wurde zu Beginn TNFalpha als Analyt gewählt. In der dieser Arbeit vorangegangen Diplomarbeit wurden vier modulare Aptazyme mit TNFalpha-Aptameren als Erkennungseinheiten entwickelt und untersucht. Da nicht nachgewiesen werden konnte, dass diese Aptazyme auf ihren Analyten reagierten, wurden in der hier vorliegenden Arbeit die Bindungseigenschaften der Aptamere mittels SPR und QCM genauer untersucht. Es wurde zweifelsfrei gezeigt, dass die verwendeten Aptamere nicht in der Lage waren, die biologisch aktive Form von TNFalpha zu binden. Im Zuge dieser Untersuchungen wurde die interessante Entdeckung gemacht, dass die Streptavidin-Biotin-Bindung, die ein weit verbreitetes Werkzeug zum Immobilisieren von Molekülen zur Untersuchung ihrer Wechselwirkung mit Bindungspartnern ist, die Ergebnisse dieser Untersuchungen beeinflussen und verfälschen kann. Zur Entwicklung des Biosensors wurde im nächsten Schritt vom modularen Aufbau Abstand genommen. Außerdem wurde ein DNAzym anstelle eines Ribozyms als Basis des zu entwickelnden Aptazyms gewählt. Die Versuche mittels in vitro Selektion Aptazmye für TNFalpha oder Kreatinin zu entwickeln scheiterten. Es ist sehr wahrscheinlich, dass diese Analyten keine geeigneten Liganden für die in vitro Selektion darstellten. Vor allem ist aber davon auszugehen, dass die Anforderung, zwei Funktionalitäten in einem Schritt zu entwickeln, zu hohe Anforderungen an den in vitro Selektionsprozess gestellt hat. Aus diesem Grund wurde eine neue und andersartige Methode mit Streptavidin als Modellanalyt entwickelt, in der die in vitro Selektion und das rationale Design kombiniert angewandt wurden. Als katalytisch aktive Einheit wurde das 17E-DNAzym gewählt. Dessen Spalteigenschaften wurden in Vorbereitung auf die folgenden Arbeiten analysiert. Es wurde ein DNA-Oligo-Inhibitor für das DNAzyme rational designed und charakterisiert. Danach wurde die das 17E-DNAzym und den Inhibitor enthaltende Bibliothek designed und dessen Funktionalität experimentell nachgewiesen. Die in vitro Selektion des Aptazyms wurde in zwei Arbeitsschritte geteilt. Im zweiten Schritt, der auf die Selektion der Bindungseigenschaft folgte, wurde der 17E-Substratstrang in die Bibliothek eingeführt, um die katalytische Aktivität zu selektieren. Im Verlauf dieser Arbeiten wurden die Kenntnisse über Selektionsprozesse, die in den ersten Versuchen mit TNFalpha und Kreatinin gewonnen wurden, erheblich ausgeweitet. Als entscheidende Faktoren des Prozesses wurden die Amplifikationsschritte und der Selektionsdruck identifiziert. Es ist notwendig, die Templatkonzentration in der PCR sehr gering zu halten, wobei die genaue Menge für jede Reaktion individuell zu definieren ist. Die in vitro Selektion ist eine Methode, die viel experimentelles Geschick, extensive Optimierungsarbeiten und vor allem Erfahrung bedarf. Um den Erfolg des ersten in vitro Selektionsschritts der neu entwickelten Methode zu überprüfen, wurde ein EMSA etabliert, womit nachgewiesen werden konnte, dass Streptavidin-Binder selektiert wurden. Allerdings blieb der zweite Schritt, die Selektion der katalytischen Aktivität erfolglos. Biacore-Experimente ermöglichten die Dissoziationskonstante des Pools zu ermitteln, der für den zweiten Schritt der in vitro Selektion eingesetzt wurde. Das Ergebnis mit KD = 38 nM belegt eine schon stark ausgeprägte Affinität der Bibliothek zu Streptavidin. Die Sequenzierung offenbarte eine sehr geringe Variabilität im verwendeten Pool. Alle identifizierten Sequenzen weisen eine klammerartige Sekundärstruktur auf, die das DNAzym in seiner inaktiven Konformation einfriert. In dieser Arbeit werden wichtige Ergebnisse für die Entwicklung von Biosensoren mittels in vitro Selektion und rationalem Design, die auf Nukleinsäuren basieren sollen, präsentiert. Außerdem wurden wichtige Arbeiten zur Etablierung einer auf Click-Chemie basierenden Immobilisierung durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Arbeit können für nachfolgende Arbeiten mit dieser Immobilisierungsstrategie verwendet werden.

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Metadaten
Author: Claudia Nübel
URN:urn:nbn:de:gbv:9-002977-4
Title Additional (English):The development of biosensors based on functional nucleic acids
Title Additional (German):Entwicklung von Biosensoren auf Basis funktioneller Nukleinsäuren
Advisor:Prof. Dr. Sabine Müller
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2018/01/02
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2017/12/08
Release Date:2018/01/02
Tag:Aptazym, DNAzym, SELEX
DNAzyme, SELEX, aptazyme
GND Keyword:4070512-2, 4165547-3, 4193016-2, 4248339-6, 4323543-8, 4441960-0, 4796824-2
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Chemie und Biochemie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 540 Chemie