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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-000617-5

Rekombinante Expression und Design der Aminoacylase 1 für die Synthese von N-Acyl-Aminosäuren

  • Im Rahmen der Dissertation wurde die Möglichkeit der enzymatischen N Acylierung von Aminosäuren über eine thermodynamisch kontrollierte Reaktion im wässrigen Medium untersucht. Eine Auswahl von Biokatalysatoren wurde auf ihre Eignung hin untersucht und die Aminoacylase 1 aus der Schweineniere (pAcy1) als Wildtyp-Enzym ausgewählt. Es konnte gezeigt werden, dass das primäre Problem bei der pAcy1-katalysierten Synthese der Modellkomponente N-Lauroyl-L-Glutamat (NLLG) in einem sehr ungünstigen thermodynamischen Gleichgewicht liegt. Dieses konnte zwar durch den pH-Wert zugunsten der Synthese verschoben werden, lieferte aber auch unter optimierten Bedingungen nur unzureichende Umsätze. Als primäre Probleme auf Seiten des Biokatalysators wurde ein niedriges Verhältnis zwischen der Synthese und Hydrolyse des Produktes (S/H-Verhältnis) neben einer vergleichsweise schlechten Akzeptanz langkettiger Acyldonoren identifiziert. Um für eine Optimierung des Enzyms die Methoden des rationalen Protein Designs und der gerichteten Evolution zu nutzen, wurde ein rekombinantes Expressionssystem über ein synthetisches Gen der pAcy1 auf dem Vektor pET52(b) realisiert. Durch die Anpassung des Expressionsmediums, der Temperatur sowie der Co-Expression molekularer Chaperone konnten etwa 80 mg aufgereinigtes Enzym pro Liter Fermentationslösung erhalten werden. Das rekombinante Protein wurde biochemisch charakterisiert und die Aktivität gegenüber dem bevorzugten Substrat der pAcy1 N-Acetyl-L-Methionin (NAM) mit 94 U/mg quantifiziert. Die Optimierung des S/H-Verhältnisses der pAcy1 fokussierte sich auf das Potential der katalytischen Base (E146) zur Protonenaufnahme. Als Basis für ein rationales Design wurde ein Strukturmodell erstellt und ein Aspartat an der Position 346 identifiziert, welches den pKa-Wert von E146 maßgeblich beeinflusst. Durch Modellierungen der Elektrostatik im aktiven Zentrum wurde die Substitution von D346 zu Alanin, Asparaginsäure, Glutamat und Glutamin vorgeschlagen und weiterhin die Mutation der katalytischen Base selbst untersucht. Versuche zur Beschreibung des S/H-Verhältnisses von erstellten Varianten der pAcy1 wurden anschließend mit NAM als Modellkomponente durchgeführt. Bei allen Mutanten war ein starker Rückgang der Gesamtaktivität zu verzeichnen, wobei die Restaktivitäten der 146X-Varianten maximal 0,5% und die der 346X-Varianten maximal 9% bei der Hydrolyse betrugen. Durch die parallele Quantifizierung der Synthesereaktion konnte gezeigt werden, dass sich das S/H-Verhältnis durch die Substitution des Asp346 in beide Richtungen verschieben lässt, wobei die gewünschte Erhöhung des Verhältnisses mit einer stark verminderten Gesamtaktivität einhergeht. Die Mutante D346A wies z.B. eine Erhöhung des S/H-Verhältnisses von 0.02 auf 0.18 auf, wobei allerdings die Restaktivität im Vergleich zum Wildtyp-Enzym bei der Synthese 0.2% und die in der Hydrolyse 0.05% betrug. Zur Erklärung dieser Beobachtungen wurde die pH-Abhängigkeit der pAcy1-Varianten für die Hydrolyse des artifiziellen Substrats Furyl-Acyl-M ethionin (FAM) bestimmt. Eine Verschiebung des pH-Optimums ins Saure bzw. ins Basische korrelierte bei D346A bzw. D346E mit der zuvor bestimmten Verschiebung des S/H-Verhältnisses. Weiterhin sollte die Affinität der pAcy1 gegenüber langkettiger Acyldonoren durch gerichtete Evolution erhöht werden. Da aus der Literatur bekannt ist, dass die Reste I177, T345, L370 die Acylbindetasche des Enzyms definieren, wurden diese über iterative Sättigungsmutagenese randomisiert und so etwa 32.000 Varianten der pAcy1 erzeugt. Zur Charakterisierung einer Mutantenbibliothek wurde ein hochdurchsatzfähiges Expressions- und Screeningsystem etabliert, wofür das bereits realisierte Expressionssystem auf den Mikrolitermaßstab übertragen und auf die besonderen Ansprüche hin optimiert wurde. Zur Charakterisierung der Enzyme wurde eine modifizierte Form eines bereits beschriebenen Proteaseassays verwendet, welcher eine kontinuierliche Messung der entstehenden Aminosäure als Produkt der Hydrolysereaktion erlaubte. Eine vorhergehende Selektion aktiver Varianten auf Minimalmedium erlaubt ein effizientes Screening der Mutantenbibliothek. Das Screening- und Selektionssystem wurde bisher mit der Wildtyp-pAcy1 und einer inaktiven Mutante erfolgreich getestet und zeigte Schwankungen von lediglich ±10%. Das noch ausstehende Screening der Mutantenbibliothek wird in laufenden Arbeiten durchgeführt.
  • In the context of the thesis the possibility of an enzymatic N-acylation of amino acids via a thermodynamically controlled reaction in the aqueous medium was examined. A selection of biocatalysts was tested for their suitability and the aminoacylase 1 from pig kidney (pAcy1) was selected as wild-type enzyme. It could be shown that the primary problem in the pAcy1-catalyzed synthesis of the model component N-lauroyl-L-glutamate (NLLG) is a very unfavorable thermodynamic equilibrium. The equilibrium could be shifted to synthesis by adjustment of water activity and pH, however, also under optimized conditions only insufficient conversions could be obtained. As the primary problems concerning the biocatalyst a low ratio between the synthesis and hydrolysis of the product (S/H-ratio) apart from a bad acceptance of long chain acyl donors was identified. In order to arrange for protein design, a recombinant expression system was realized using a synthetic pACY1 gene integrated in the pET52(b) vector system. By adjustment of the expression conditions and co-expression of molecular chaperones during the fermentation, a yield of 80 mg purified enzyme was obtained per litre culture medium. The recombinant protein was biochemically characterized and the activity towards the preferred substrate of the pAcy1 N-acetyl-L-methionine (NAM) was quantified with 94 U/mg. The rational optimization of the S/H-ratio of the pAcy1 focused on the potential of the catalytic base (E146) for the specific proton acceptor potential. As the basis for this rational design a structural model was constructed and an aspartate at the position 346 was identified, which affects the pKa value of E146 considerably. By modeling of the electrostatics in the active center the substitution of D346 was to alanine, asparagine acid, glutamate and glutamine and also the mutation of the catalytic base was suggested and then examined. Attempts for the description of the S/H relationship of provided variants of the pAcy1 were accomplished with NAM as the model component. With all mutants a strong decrease of the total activity was observed. Residual hydrolytic activities of the 146X-mutants amounted to maximally 0.5% and those of the 346X-mutants yielded at best only 9% of wild-type activity. Parallel quantification of the synthesis reaction demonstrated that the S/H-ratio is movable by the substitution of the Asp346 in both directions, whereas the desired increase of the relationship was accompanied by a strongly decreased total activity. The mutant D346A for example exhibited an increase of the S/H ratio from 0.02 to 0.18, but the residual activity in comparison to the wt-enzyme amounted to 0.2% in synthesis and 0.05% in hydrolysis. In order to explain these observations, the pH-dependency of the pAcy1-variants was investigated in the hydrolysis of the artificial substrate furyl-acryloyl-L-methionine (FAM). A shift of the pH-optimum to acidic or basic conditions correlated with the shift of the S/H-ratio determined before for D346A and D346E. Furthermore, the affinity of pAcy1 towards long chain acyl donors should be increased by directed evolution. Since literature references define the residues I177, T345, L370 as the acyl binding pocket of the enzyme, these residues were randomized using iterative saturation mutagenesis and a library with 32,000 pAcy1-variants was constructed. For the characterization of this library a high-throughput expression and screening-system was established. For this, the already realized expression system was optimized regarding the special requirements for expression in micro titer plates. For the characterization of the library a modified form of an already described protease assay was used, which permitted a continuous measurement of the amino acid as the product of the hydrolysis reaction. A pre-selection of active variants on minimal medium allowed an efficient screening of the library. The screening and selection systems were tested so far successfully with the wt-pAcy1 and an inactive E146A-mutant and show fluctuations of ±10%. The screening procedure will be accomplished in current work.

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Metadaten
Author: Rainer Wardenga
URN:urn:nbn:de:gbv:9-000617-5
Title Additional (English):Recombinant expression and design of aminoacylase 1 for the synthesis of N-acyl-L-amino acids
Advisor:Prof. Uwe Bornscheuer
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2009/05/15
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2009/03/20
Release Date:2009/05/15
GND Keyword:Biotechnologie, Heterologe Genexpression
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Chemie und Biochemie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 540 Chemie