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Funktion von Nrf2 und Glutathion bei Infektionen mit Burkholderia pseudomallei

  • Infektionserkrankungen können im Wirt oxidativen Stress hervorrufen, da dieser zur gezielten Abwehr von Mikroorganismen mithilfe bestimmter Immunzellen erhebliche Mengen an reaktiven Sauerstoff- und Stickstoffspezies produziert. Dabei wird v. a. der Aktivität der NADPH-Oxidase, und weniger der induzierbaren NO-Synthase, eine wichtige Rolle bei der Eliminierung von B. pseudomallei zugeschrieben (Utaisincharoen et al. 2001; Breitbach et al. 2006), was sich wiederum toxisch auf körpereigenes Gewebe auswirken kann. Unter diesen Umständen ist ein gut funktionierendes, antioxidatives Schutzsystem der Zellen von essentieller Bedeutung. In dem Zusammenhang sollte zum einen die antioxidative Funktion des Transkriptionsfaktors Nrf2, und zum anderen die Bedeutung des Glutathion-Redoxsystems bei Infektionen mit dem Gram-negativen, fakultativ intrazellulären Erreger der Melioidose, Burkholderia pseudomallei, geklärt werden. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Infektion von Makrophagen und Hepatomzellen mit B. pseudomallei zur nukleären Translokation von Nrf2 und somit dessen Aktivierung beiträgt. Die infektionsbedingte Induktion von Nrf2 auf Genexpressionsebene wurde in Makrophagen, jedoch nicht in Hepatomzellen, festgestellt. Darüber hinaus wurde die Genexpression des Transkriptionsfaktors in den Organen von infizierten C57BL/6-Mäusen unterschiedlich reguliert. Die Anwesenheit von Nrf2 in Nrf2+/+-Makrophagen bzw. die Aktivierung von Nrf2 durch Stimulatoren verbesserten das intrazelluläre Überleben von B. pseudomallei in den Immunzellen, wohingegen in infizierten Hepatomzellen das Replikationsvermögen des Pathogens durch Nrf2 eingeschränkt wurde. In vitro-Infektionsversuche mit anderen Bakterien wiesen zudem auf einen Erreger-spezifischen Einfluss von Nrf2 hin. Des Weiteren war die proinflammatorische Antwort von Makrophagen durch Nrf2 tendenziell, aber nicht signifikant, erhöht. Im pulmonalen in vivo-Infektionsmodell hatte Nrf2 weder einen Einfluss auf das Wachstum von B. pseudomallei in Leber, Lunge und Milz infizierter Tiere, noch auf die Sekretion inflammatorischer Mediatoren im Serum. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass Nrf2 weniger durch die Modulation der proinflammatorischen Immunantwort, als vielmehr durch die Regulation ARE-abhängiger, antioxidativer Proteine unterschiedlich auf die mikrobielle Abwehr in vitro und in vivo einwirkt. Im zweiten Teil der Arbeit sollte daher die Rolle von Glutathion (GSH) und den an seiner Biosynthese bzw. Regeneration beteiligten Enzymen, Glutamatcysteinligase (Gcl) sowie Glutathionreduktase (Gsr), bei der Infektion mit B. pseudomallei untersucht werden. Es konnte nachgewiesen werden, dass die Genexpression der Gcl und Gsr in Abhängigkeit von der infektionsbedingten Nrf2-Induktion durch B. pseudomallei in Makrophagen erhöht war, wohingegen die Enzyme in den Organen infizierter Mäuse unterschiedlich induziert wurden. Die Inhibition der Gcl führte sowohl in Makrophagen als auch in Hepatomzellen zu einer Reduktion des intrazellulären Gesamt-GSH-Gehaltes, was sich jedoch unterschiedlich auf das Wachstumverhalten von B. pseudomallei in den jeweiligen Zellen auswirkte. Die eingeschränkte GSH-Biosynthese verbesserte zum einen die Pathogenkontrolle in den Makrophagen und im Mausmodell, begünstigte jedoch zum anderen die Replikation des Erregers in Hepatomzellen. Die Hemmung der Regeneration von GSH aus GSSG führte ebenfalls zu zelltypabhängigen, kontroversen Ergebnissen. Einerseits wirkten sich die Inhibition der Gsr und der damit verbundene GSH-Mangel positiv auf das Überleben von B. pseudomallei in Makrophagen aus. Andererseits führte die Gsr-Inhibition in Hepatomzellen zu einem Anstieg des intrazellulären GSH-Gehaltes, was sich in reduzierten Keimzahlen äußerte. Wurde GSH direkt mithilfe eines bestimmten Konjugationspartners, der aber auch für seine Nrf2-induzierende Wirkung bekannt ist, depletiert, so wurde das bakterielle Wachstum in beiden Zelltypen und in den Organen von Mäusen begünstigt. Da der GSH-Gehalt in unseren Infektionsmodellen keinen signifikanten Einfluss auf proinflammatorische Mediatoren hatte, ist anzunehmen, dass die wirtsvermittelten Immunmechanismen eine untergeordnete Rolle bei der Pathogenkontrolle spielen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit bestätigen die in der Literatur bereits kontrovers beschriebenen Funktionen von Nrf2 und GSH bei mikrobiellen Infektionen. Es ist anzunehmen, dass sowohl der Nrf2-Signalweg als auch die Nrf2-abhängige Regulation des GSH-Stoffwechsels vorwiegend dem Schutz der Wirtszelle dienen, indem sie das durch eine Infektion hervorgerufene, gestörte Gleichgewicht zwischen ROS und Antioxidantien wiederherstellen. Jedoch konnte auch gezeigt werden, dass beide Faktoren unter bestimmten Bedingungen zugunsten des bakteriellen Wachstums genutzt werden können, indem das Pathogen die Schutzmechanismen des Wirtes umgeht.
  • Oxidative stress caused by infectious diseases results in increased production of reactive oxygen and nitrogen species in cells of the immune system. It’s already known that the NADPH oxidase seems to be essential for the elimination of B. pseudomallei (Utaisincharoen et al. 2001; Breitbach et al. 2006), but also cytotoxic in cells and tissues. Thus, understanding the function of antioxidant systems is essential to decrease toxic effects of disturbances in the redox state as well as infectious processes. This study was designed to investigate the role of the transcription factor Nrf2 and the glutathione redox system during infection with B. pseudomallei, the causative agent of melioidosis, and to elucidate their function in bacterial host defence. In the present work, it could be shown that infection with B. pseudomallei leads to nuclear accumulation and activation of the transcription factor Nrf2 in macrophages and hepatoma cells, which was associated with increased gene expression of Nrf2 in macrophages but not in hepatoma cells. Furthermore, the gene expression of Nrf2 was differentially regulated in organs of infected C57BL/6 mice. Both presence of Nrf2 in Nrf2+/+ macrophages and induction of Nrf2 through its chemical activators improved intracellular survival of the pathogen in immune cells, whereas bacterial growth was reduced in hepatoma cells. There were no significant changes in gene expression of proinflammatory cytokines in infected macrophages. Besides, in vitro studies with other bacteria indicated a pathogen-specific influence of Nrf2. In a pulmonary infection model Nrf2 affected neither bacterial loads in liver, lung and spleen nor secretion of inflammatory mediators in serum. Thus, it’s most likely that Nrf2 contributes to the observed differing effects in vitro and in vivo through regulation of antioxidant enzymes. In the second part we investigated the role of glutathione (GSH) and its biosynthesizing and regenerating enzymes glutamate-cysteine ligase (Gcl) and glutathione reductase (Gsr) during infection with B. pseudomallei. Infection of macrophages led to Nrf2-dependent increase of gene expression of both enzymes, whereas mRNA-levels were differentially regulated in organs of infected mice. The inhibition of Gcl diminished total intracellular amounts of GSH which resulted in decreased bacterial numbers in macrophages and improved replication of B. pseudomallei in hepatoma cells. The lack of GSH through inhibition of Gsr promoted intracellular survival of the pathogen in macrophages. In contrast, Gsr inhibition led to increased GSH amounts in hepatoma cells resulting in reduced bacterial numbers. Treatment of macrophages and hepatoma cells with the GSH depletor DEM, that is also known for its Nrf2-inducing properties, led to enhanced bacterial growth in vitro and in vivo. Since there was no significant influence of GSH on proinflammatory mediators our data suggest that host-mediated immune responses do not play a central role in the pathogen control. The results confirm the controversially discussed functions of Nrf2 and GSH during infectious diseases. It can be assumed that the Nrf2 pathway as well as the Nrf2-dependent regulation of the GSH homeostasis can be cytoprotective through redressing the impaired balance between ROS and antioxidants. Nevertheless, under certain conditions it is also shown that the pathogen might evade the host defence mechanisms to improve its replication strategies.

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Metadaten
Author: Claudia Stolt
URN:urn:nbn:de:gbv:9-002453-4
Title Additional (English):Function of Nrf2 and glutathione during infections with Burkholderia pseudomallei
Advisor:Prof. Dr. Ivo Steinmetz
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2016/03/03
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2016/02/18
Release Date:2016/03/03
Tag:Nrf2
GND Keyword:Antioxidans, Burkholderia, Glutathion, Infektion, Oxidativer Stress, Transkriptionsfaktor, Tropenkrankheit
Faculties:Universitätsmedizin / Friedrich-Loeffler-Institut für Medizinische Mikrobiologie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie