• search hit 11 of 14
Back to Result List

Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-000553-0

The human antibody response to experimental colonization with Staphylococcus aureus NCTC8325-4

  • The four main work packages and their most important results are briefly described as following. 1. Characterization of the extracellular proteome of S. aureus NCTC8325-4 Reference maps of the extracellular proteins of S. aureus NCTC8325-4 were produced at pH ranges 6-11 and 4-7. In total, 119 (pH 6-11) and 177 (pH 4-7) protein spots were identified, corresponding to 48 and 114 proteins, respectively. Among them were many well-known virulence factors such as alpha-hemolysin (Hla), beta-hemolysin Hlb, gamma-hemolysin subunits (HlgA-C), hyaluronate lyase (HysA) and staphylococcal superantigen-like protein 11 (Ssl11). We also detected various extracellular enzymes, which can cause tissue degradation and are involved in nutrient acquisition, for example, autolysin (Atl), glycerol ester hydrolase (Geh), lipase (Lip), thermonuclease (Nuc), several serine proteases SplA-F (SplA-F), V8 protease (SspA), cysteine protease (SspB), staphopain thiol proteinase (88195808, SspP). Many of these proteins probably also contribute to the virulence of S. aureus. 2. Optimization of a 2-D immunoblot (IB) method for the comprehensive investigation of IgG binding to S. aureus extracellular proteins (strain NCTC8325-4) The immune proteome of S. aureus NCTC8325-4 was revealed by probing 2-D blots of S. aureus extracellular proteins at the two pH ranges 6-11 and 4-7 with a pool of sera from 16 volunteers. IgG binding was detected with high sensitivity using a peroxidase-coupled secondary Ab in combination with an ECL-substrate. With application of the software package Delta2D, we could clearly define 66 immune reactive spots on the immunoblots (IBs) of pH range 6-11 and 38 spots on IBs of pH range 4-7. 72 of these 104 immune reactive spots could be identified by matching the IBs with the protein reference maps. These spots represented 36 identified proteins, many of which are known virulence factors, or they are involved in bacterial cell wall biosynthesis and degradation. Generally, the most abundant proteins were also highly immune reactive, but there was no strict correlation between protein abundance and immune reactivity. Some low abundance proteins, especially basic proteins, showed high immune reactivity on 2-D IBs, for example, Atl, 88195808 (SspP) and iron-regulated surface determinant protein A (IsdA). On the other hand, we observed proteins, which were present in large amounts but did not bind IgG such as peptidoglycan hydrolase (LytM) and a hypothetical protein 88193909 (SAOUHSC_00094). 3. Determination of the anti-staphylococcal Ab profiles of S. aureus carriers and noncarriers Comparing the serum IgG binding patterns of sera from the 16 individual volunteers, we observed pronounced heterogeneity in total IgG binding, spot patterns and spot intensities. Five spots were stronger in carriers than in noncarriers (P< 0.05, Mann-Whitney U test). These spots represent IgG binding to SspA, SspB, IsaA, and two hypothetical proteins. A principal component analysis based on differential IgG binding to these spots showed that the carriers were more closely related to each other than the noncarriers, but that they could not be clearly separated from the noncarriers. 4. Does experimental colonization induce changes of the anti-staphylococcal Ab profiles? Finally, we tested whether symptom-free experimental colonization of the 16 volunteers with S. aureus NCTC8325-4 elicited an IgG response. When we compared sera obtained before colonization with those taken 4 weeks after the inoculation with the laboratory S. aureus strain, we did not observe major changes in the Ab patterns. We conclude that short- term colonization with a strain of low virulence does not suffice to induce an Ab production, which is comparable to that present already before the colonization. Thus, either long term high density colonization is required, or as we consider most likely, the adaptive immune response is primarily triggered by (minor) S. aureus infections. Taken together, in this work we have separated the soluble proteins from complex extracellular S. aureus protein extracts with good reproducibility, large coverage (pH 6-11 and 4-7) and high resolution. With application of an ECL substrate, our 2-D immunoblotting procedure resulted in the highly sensitive detection of IgG binding over a wide range of signal intensities. The most important finding with this technique was the pronounced variability of anti-staphylococcal Ab profiles in healthy adults. This could well explain differences in susceptibility to S. aureus infection and its complications. The Ab responses are presumably triggered by long-term colonization or, more likely, by minor infections with S. aureus, since experimental nasal colonization of healthy volunteers with a bacterial strain of low virulence did not induce impressive changes in the Ab profiles.
  • Die vier Arbeitsschwerpunkte und ihre Ergebnisse werden kurz dargestellt im Folgenden. 1. Charakterisierung des extrazelluären Proteoms von S. aureus NCTC8325-4 Referenzkarten der extrazellulären Proteine von S. aureus NCTC8325-4 wurden für die pH Bereiche 6-11 und 4-7 erstellt. Insgesamt wurden 119 (pH 6-11) bzw. 177 (pH 4-7) Proteinspots identifiziert, die 48 bzw. 114 Proteinen zugeordnet werden konnten. Unter den Exoproteinen waren bekannte Virulenzfaktoren wie Alphahämolysin (Hla), Betahämolysin (Hlb), Gammahämolysin (HlgA-C), Hyaluronatlyase (HysA) und Staphylococcal Superantigen-like Protein 11 (Ssl11). Wir fanden auch verschiedene extrazelluläre Enzyme, die Wirtsgewebe lysieren und somit auch Nährstoffe bereitstellen, wie zum Beispiel Autolysin (Atl), Glycerolesterhydrolase (Geh), Lipase (Lip), Thermonuclease (Nuc), verschiedene Serinproteasen SplA-F (SplA-F), V8-Protease (SspA), Cysteinprotease (SspB), Staphopain-Thiolproteinase (88195808, SspP). Viele dieser Proteine tragen vermutlich zur Virulenz von S. aureus bei. 2. Optimierung der 2D-Immunoblot (IB) Methode für die umfassende Untersuchung der Serum-IgG-Bindung an extrazelluäre Proteine von S. aureus (strain NCTC8325-4) Das Immunproteom von S. aureus NCTC8325-4 wurde charakterisiert, indem 2D-IBs von S. aureus extrazellulären Proteinen (pH Bereiche 6-11 und 4-7) mit einem Serumpool von 16 gesunden Individuen inkubiert wurden. IgG-Bindung wurde mit einem hochsensitiven ECL-Substrat in Verbindung mit einem Peroxidase-gekoppelten anti-human IgG-Antikörper nachgewiesen und quantifiziert. Mit Hilfe der Delta2D-Software konnten wir auf den 2D-IBs mit dem pH Bereich 6-11 66 immunreaktive Proteinspots und auf den IBs mit pH 4-7 38 Spots detektieren. 72 dieser insgesamt 104 immunreaktiven Spots konnten durch Überlagerung der IBs mit den Proteinreferenzkarten identifiziert werden. Diese Spots gehören zu 36 verschiedenen Proteinen, von denen viele bekannte Virulenzfaktoren oder aber in den Zellwandstoffwechsel involviert sind. In der Regel waren die stark abundanten Proteine auch sehr immunreaktiv, aber es gab keine strikte Korrelation zwischen Proteinmenge und IgG-Bindung. Einige wenig abundante Spots, insbesondere die basischen Proteine wie Atl, 88195808 (SspP) und iron-regulated surface determinant protein A (IsdA), zeigten eine starke IgG-Bindung im 2D-IB. Anderseits waren einige Proteine sehr abundant aber wiesen keine IgG-Bindung auf, wie zum Beispiel Peptidoglycanhydrolase (LytM) und ein hypothetisches Protein 88193909 (SAOUHSC_00094). 3. Bestimmung des Antikörperprofils gegen S. aureus von Carriern und Nichtcarriern Ein Vergleich der Serum-IgG-Bindungsmuster von 16 Individuen zeigte eine ausgesprochene Vielfalt in der Gesamt-IgG-Bindung, dem Spotmuster und den Spotintensitäten auf. Fünf Spots waren stärker in Carriern als in Nichtcarriern (P< 0.05, Mann-Whitney U-Test). Diese IB-Spots entsprechen den Proteinen SspA, SspB, IsaA, sowie zwei hypothetischen Proteinen. Eine PCA-Analyse basierend auf diesen fünf Spots gruppierte zwar die Carrier, führte jedoch nicht zu einer klaren Trennung der Carrier von den Nichtcarriern. 4. Induziert die experimentelle nasale Besiedlung eine Antikörperantwort? Abschließend haben wir untersucht, ob die symptomfreie experimentelle Besiedlung von 16 Probanden mit S. aureus NCTC8325-4 eine Serum-IgG-Antwort auslöst. Ein Vergleich der Antikörpermuster vor und 4 Wochen nach Besiedlung mit dem Laborstamm zeigte keine deutlichen Veränderungen in der IgG-Bindung. Wir schlussfolgern, dass die kurzzeitige Besiedlung mit einem kaum virulenten Laborstamm nicht ausreicht um eine Antikörperproduktion zu induzieren. Deshalb sind entweder eine Langzeitbesiedlung mit hoher Besiedlungsdichte oder, wahrscheinlicher, (kleinere) S. aureus-Infektionen nötig, um eine adaptive Immunantwort auszulösen. Zusammenfassung In dieser Arbeit wurden die löslichen Proteine aus komplexen extrazellulären Proteinextrakten mit guter Reproduzierbarkeit, hoher Abdeckung (pH Bereich 6-11 und 4-7) und hoher Auflösung in der 2D-PAGE aufgetrennt und identifiziert. Mittels eines ECL-Substrats konnte die IgG-Bindung an extrazelluäre S. aureus-Proteine mit hoher Sensitivität und über einen großen Signalbereich nachgewiesen werden. Das wichtigste Ergebnis unserer Untersuchungen ist die ausgesprochen hohe Variabilität in den anti-S. aureus-Antikörperprofilen bei gesunden Individuen. Diese Unterschiede könnten durchaus die unterschiedliche Suszeptibilität für S. aureus – Infektionen und deren Komplikationen erklären. Antikörperantworten werden vermutlich durch Langzeitbesiedlung oder, wahrscheinlicher, kleinere Infektionen mit S. aureus ausgelöst, da die experimentelle nasale Besiedlung von gesunden Probanden mit einem wenig virulenten Stamm keine deutlichen Veränderungen im Antikörperprofil ausgelöst hat.

Download full text files

Export metadata

Additional Services

Share in Twitter Search Google Scholar
Metadaten
Author: Thi Thu Hoai Nguyen
URN:urn:nbn:de:gbv:9-000553-0
Title Additional (German):The human antibody response to experimental colonization with Staphylococcus aureus NCTC8325-4
Advisor:Prof. Dr. Uwe Völker, Prof. Alex van Belkum, Prof. Dr. Barbara Bröker
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2008/12/18
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Medizinische Fakultät (bis 2010)
Date of final exam:2008/12/10
Release Date:2008/12/18
Tag:Antikörperantworten, Staphylococcus aureus
Antibody response, Staphylococcus aureus, colonization
GND Keyword:Antikörperantworten
Faculties:Universitätsmedizin / Institut für Immunologie u. Transfusionsmedizin - Abteilung Immunologie
DDC class:600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften / 610 Medizin und Gesundheit