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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002133-3

Proteomic characterization of host-pathogen interactions using human cell lines infected with Staphylococcus aureus HG001 as a model

  • Staphylococcus aureus is a commensal that colonizes the skin and mucosa of 20-30% of the human population without leading to symptoms of diseases. However, it is also the most important cause of nosocomial infections. Those range from minor skin infections to life-threatening diseases such as pneumonia, endocarditis or septicaemia. Development of strains with resistance against many antibiotics complicates the situation further. The variety of strains with their various properties is one reason why no successful vaccine has been introduced to the market, yet. Therefore, efficient strategies for prevention and therapy of these dangerous infections are urgently needed. To accomplish these goals, the understanding of molecular interactions between host and pathogen is indispensable. Within this dissertation, several internalization experiments were performed aiming to investigate the interaction of S. aureus HG001 and human cell lines upon infection on the protein level. In order to obtain sufficient amounts of proteins for comprehensive physiological interpretations, it is necessary to enrich bacteria, secreted bacterial proteins or infected host cells upon internalization. In the framework of this thesis, bacteria which continuously produce green fluorescent protein (GFP) were employed. With that it was possible to sort bacteria from lysed host cells by flow cytometry or to separate host cells carrying bacteria after contact from those which did not. Subsequently, the proteins were proteolytically digested and peptides were analyzed by mass spectrometry in a gel-free proteomics approach. To allow such analyses also for staphylococci which do not produce GFP, such as clinical isolates, an additional protocol was developed. Prior to the infection, bacteria were labeled with fluorescent or para-magnetic nanoparticles. Afterwards bacteria could be separated from host cell debris by fluorescence-based cell sorting or with the help of a strong magnet. In order to cover also important secreted virulence factors of S. aureus HG001, phagosomes and engulfed bacteria and secreted proteins were isolated from infected host cells. Further steps of protocol optimization included improved bacterial cell counting by fluorescence-based flow cytometry, enhanced data analysis by combination of different search algorithms, and comprehensive functional annotation of proteins of the applied strain by sequence comparison with other strains and organisms. First, the proteome adaptation of internalized S. aureus HG001 and the infected A549 host cells was investigated during the first hours of infection. It became clear, that the bacteria replicate inside the host during the first 6.5 h. After internalization the levels of bacterial enzymes involved in protein biosynthesis decreased. Furthermore, bacteria adapted their proteome to the harsh intracellular conditions such as oxygen limitation, cell wall stress, host defense in terms of oxidative stress, and nutrient limitation. After contact to S. aureus HG001, A549 cells produced increased amounts of cytokines (e.g. IL-8, IFN-γ) in comparison to non-treated A549 cells. In addition, activation of the immunoproteasome and hints of early apoptosis activity were observed. Afterwards, the response of S. aureus HG001 to internalization by A549, S9 or HEK 293 cells was compared on the proteome level. It was obvious, that the adaptation to stress and the reduced protein synthesis are conserved mechanisms. Host dependent differences were detected especially in the energy metabolism and the synthesis of some amino acids. Additionally, bacteria showed different intracellular replication patterns depending on the host cell line. A higher percentage of extracellular bacterial proteins was found in isolated phagosomes compared to the sorted samples. Selected low abundant virulence factors could be quantified at two points in time after infection with the help of the sensitive single reaction monitoring (SRM) method. Further, a heterogeneous mixture of several phagosomal maturation steps was present during the first 6.5 h after infection. Finally, the gel-free proteome analyses could be applied to investigate Bordetella pertussis, the cause of whooping cough, during iron limitation and after internalization, and the results were compared to the S. aureus HG001 data.
  • Staphylococcus aureus ist ein Kommensale, der Haut und Schleimhäute von 20-30% der Menschen besiedelt ohne Krankheitssymptome auszulösen, aber es ist auch der bedeutendste humanpathogene Erreger nosokomialer Infektionen. Das Krankheitsspektrum umfasst leichtere Hautinfektionen sowie lebensbedrohliche Infektionen wie Lungenentzündung, Endokarditis oder Sepsis. Erschwerend kommt hinzu, dass sich hochpathogene Stämme entwickelt haben, die gegen den Großteil derzeit verfügbarer Antibiotika resistent sind. Die Vielzahl der Stämme mit unterschiedlichen Eigenschaften und Anpassungsmöglichkeiten ist ein Grund dafür, dass noch kein erfolgreich einsetzbarer Impfstoff für Menschen auf dem Markt ist. Daher ist es dringend notwendig neue effektive Strategien für Vorbeugung und Therapie zu entwickeln. Dafür ist das Verständnis des Zusammenspiels von Erreger und Wirt auf molekularer Ebene unabdingbar. In dieser Dissertation wurden Internalisierungsexperimente durchgeführt, die es erlaubten das Wechselspiel zwischen S. aureus HG001 und humanen Zelllinien infolge einer Infektion auf Proteinebene zu untersuchen. Um ausreichende Proteinmengen für physiologische Rückschlüsse zu erhalten, ist es nötig Bakterien, sezernierte bakterielle Proteine, beziehungsweise infizierte Wirtszellen nach einer Internalisierung anzureichern. In dieser Arbeit wurden Bakterien verwendet, die kontinuierlich das grün fluoreszierende Protein (GFP) produzieren. Damit war es möglich mittels Durchflusszytometrie Bakterien aus lysierten Wirtszellen zu sortieren. Zudem konnten Wirtszellen, die Bakterien aufgenommen hatten, von denen getrennt werden, die keine Bakterien enthielten. Anschließend wurden die Proteine proteolytisch verdaut und die Peptide mittels gel-freier Proteomanalysen massenspektrometrisch untersucht. Um mit Staphylokokken arbeiten zu können, die kein GFP produzieren, wie zum Beispiel klinische Isolate, wurde ein weiteres Protokoll entwickelt. Dabei wurden die Bakterien vor einer Infektion mit fluoreszierenden oder para-magnetischen Nanopartikeln markiert. Anschließend konnten die Bakterien mittels Durchflusszytometrie oder mit einem starken Magneten von Wirtszelltrümmern getrennt werden. Um wichtige sezernierte Virulenzfaktoren von S. aureus HG001 erfassen zu können, wurden Phagosomen und die darin enthaltenen Bakterien und sezernierten Proteine aus infizierten Zellen angereichert. Weitere Schritte der Protokolloptimierung in dieser Doktorarbeit umfassten unter anderem eine Optimierung der Zellzählung mittels fluoreszenz-gestützter Durchflusszytometrie, verbesserte Datenanalyse durch Kombination verschiedener Suchalgorithmen sowie eine umfangreichere Annotierung der Proteinfunktionen des verwendeten Stammes durch Sequenzvergleiche mit anderen Stämmen bzw. Organismen. Mithilfe der optimierten oder entwickelten Protokolle konnten umfassende Proteomanalysen zu den Wechselwirkungen zwischen S. aureus HG001 sowie den humanen Zelllinien A549, S9 und HEK 293 durchgeführt werden. Zuerst wurden die Proteomanpassungen internalisierter S. aureus HG001 Zellen sowie die der infizierten A549 Wirtszellen in den ersten Stunden der Infektion untersucht. Dabei wurde deutlich, dass sich die Bakterien in den ersten 6,5 h im Wirt vermehren. Nach Internalisierung verringerte sich die Menge der bakteriellen Proteinsyntheseenzyme im Vergleich zu Kontrollbakterien. Außerdem passten die Bakterien ihr Proteom an die harschen intrazellulären Bedingungen wie Sauerstoffmangel, Zellwandstress, Wirtsabwehr in Form von oxidativem Stress sowie Nährstoffmangel an. Nach Kontakt mit S. aureus HG001 produzierten A549 Zellen verstärkt Zytokine (v.a. IL-8, IFN-γ) im Vergleich zu unbehandelten A549 Zellen. Weiterhin wurden eine Aktivierung des Immunoproteasoms sowie Hinweise auf frühe Apoptoseaktivität detektiert. Anschließend wurde die Anpassung von S. aureus HG001 auf Proteomebene nach Internalisierung durch A549, S9 oder HEK 293 Zellen verglichen. Hier wurde deutlich, dass die Anpassung an Stress und eine geringere Proteinsynthese konservierte Antwortmechanismen an eine Internalisierung darstellen. Unterschiede wurden vor allem im Energiestoffwechsel und bei der Synthese von Aminosäuren beobachtet. Zudem zeigten die Bakterien unterschiedliche intrazelluläre Replikationsmuster in Abhängigkeit vom Wirt. In isolierten Phagosomen wurde ein erhöhter Anteil extrazellulärer Bakterienproteine im Vergleich zu den sortierten Proben detektiert. Ausgewählte niedrigabundante Virulenzfaktoren konnten mithilfe der sensitiven SRM Methode zu zwei Zeitpunkten nach der Infektion quantifiziert werden. Zudem wurde festgestellt, dass eine heterogene Mischung verschiedener Phagosomenreifungsstufen in den ersten 6,5 h nach Infektion vorlag. Schließlich konnten die gel-freien Proteomanalysen angewendet werden um den Keuchhustenerreger Bordetella pertussis unter Eisenmangel und nach Internalisierung zu untersuchen und die Ergebnisse mit den Daten für S. aureus HG001 zu vergleichen.

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Metadaten
Author: Kristin Surmann
URN:urn:nbn:de:gbv:9-002133-3
Title Additional (German):Charakterisierung von Wirt-Erreger-Interaktionen von Infektionen menschlicher Zelllinien mit Staphylococcus aureus HG001 durch Proteomanalysen
Advisor:Prof. Dr. Uwe Völker
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2015/02/03
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2014/12/15
Release Date:2015/02/03
Tag:Staphylococcus aureus, Wirt-Erreger-Interaktionen, humane Zelllinien
Staphylococcus aureus, host-pathogen interactions, human cell lines
GND Keyword:Infektionen, Molekularbiologie, Proteomics
Faculties:Universitätsmedizin / Arbeitsgruppe "Funktionelle Genomforschung"
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie