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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-000891-2

Proteomanalysen humaner S9-Epithelzellen und von Staphylococcus aureus als Grundlage zur Untersuchung der Wirt-Erreger-Interaktion

  • Infektionen durch Staphyloccocus aureus können aufgrund zunehmender Therapieresistenz (ca-MRSA, ha-MRSA, la-MRSA etc.) gravierende Verläufe nehmen und stellen nicht nur eine wachsende medizinische, sondern auch eine gesundheitsökonomische Herausforderung im Patientenmanagement dar. Für die Entwicklung innovativer Behandlungsstrategien ist die genaue Analyse der keimspezifischen Infektionsmechanismen eine wichtige Voraussetzung. S. aureus verwendet sogenannte Virulenzfaktoren um einen zunächst lokalen Infektionsherd zu etablieren. Wachstumsphasenabhängig werden z.B. Adhäsine, Kapselantigene oder Toxine exprimiert, um dann gezielt im Infektionsgeschehen eingesetzt zu werden. In den vergangenen Jahren konnten wichtige Fortschritte zur Ermittlung infektionsrelevanter stammspezifischer Regulationsmechanismen bei S. aureus gemacht werden. Ziel dieser Arbeit war zunächst eine Datengrundlage zur Untersuchung der Wirt-Erreger-Interaktion durch Proteomreferenzkarten von humanen S9-Epithelzellen zu schaffen. Zudem wurden die extrazellulären Expressionsmuster von S. aureus-Isolat NCTC8325-4 in verschiedenen Kulturmedien analysiert, um ein geeignetes Medium für die Kokultur der Wirts –wie auch der Erregerzellen entwickeln. Weiterhin sollte eine Proteomreferenzkarte der extrazellulären Proteinfraktion von S.aureus RN1HG erstellt werden, um eine anschließende Vergleichsanalyse der wachstumsphasenabhängigen Expressionsprofile zu ermöglichen. Zur Erstellung der Proteomreferenzkarten wurden die Proteingemische mit einer zweidimensionalen Gelelektrophorese (2D PAGE) aufgetrennt. Zuerst wurden die Proteine einer isoelektrischen Fokussierung unterworfen (IPG – Streifen 24cm für pI 4-7; 11cm u. 18cm für pI 6-11) und dann in der zweiten Dimension nach ihrer Größe mit 12,5% SDS Polyacrylamidgelelektrophorese separiert (Trennbereich 20 -120 kD). Die Proteinspots wurden mit verschiedenen Färbemethoden (Silbernitrat, kolloidales Coomassie Brillantblau oder Flamingo Fluoreszenzfärbung) dargestellt. Mit MALDI-TOF wurden die Proteine sequenziert und quantifiziert. Die gefundenen Sequenzen wurden durch Datenbanksuche (Mascot 2.0; SwissProt 55.1_human/all) identifiziert. Auf Wirtsseite sollten die humanen S9-Epithelzellen (CFTR repaired IB3-1) als Modell einer bakteriellen Atemwegskolonisation dienen, dabei wurden sie in MEM (mit 4% FCS, 1% NEAA (non essential amino acids) und 4 mM L-Glutamin) kultiviert. Auf der Erregerseite wurden die S. aureus - Isolate NCTC8325-4 (11-bp deletion in rsbU, cured of three prophages) und RN1HG (rsbU restored) (HG001; Herbert S. et al, 2010) verwendet . Proteomreferenzkarten für den pI Bereich pI 4-7 und pI 6-11 wurden für das Proteom der S9-Epithelzellen angefertigt. Es wurden 668 Einzelproteine (508 mit Proteinscore >55) identifiziert und funktionell via Datenbanksuche (www.pantherdb.org) charakterisiert. Somit können infektionsassoziierte Veränderungen im Proteinmuster der S9-Wirtszellen erkannt und valide ausgewertet werden. Um eine Kokultur für Internalisierungsversuche von S.aureus und den S9-Epithelzellen zu ermöglichen, wurde eine methodenoptimierende Kultivierungsreihe (MEM mit und ohne 5%FCS, RPMI 1640, TSB) mit dem Laborstamm NCTC8325-4 durchgeführt. Der Datenvergleich der extrazellulären Expressionsmuster trug zur Entwicklung eines geeigneten Kulturmediums (MEM mit 2mM AS supplementiert) bei. S. aureus RN1HG wurde in diesem Medium kultiviert und von der extrazellulären Proteinfraktion wurde eine Proteomreferenzkarte im Bereich pI 4-7 angefertigt. Es konnten 91 Einzelproteine (48 mit Proteinscore >55) identifiziert werden. Durch eine vergleichende Analyse konnten Veränderungen der Proteinmuster innerhalb verschiedener Wachstumsphasen (exponentiell, transient, stationär und spät stationär) detektiert und ein optimaler Erntezeitpunkt festgelegt werden. Während der exponentiellen Wachstumsphase waren typischerweise kolonisationsrelevante Proteine (LytM, SAOUHSC_02979, SceD), in der stationären Phase vorrangig invasionsrelevante (SsaA, IsaA, SspB) angereichert. Somit konnten charakteristische Expressionsmerkmale bei S. aureus RN1HG nachgewiesen werden, welche den weiteren Einsatz gemeinsam mit den S9-Epithelzellen ermöglichen (Schmidt F. et al., 2010).
  • Due to increasing multiresistance to frequent therapeutics, infections caused by Staphylococcus aureus (ca-MRSA, ha-MRSA, la-MRSA etc.) may provoke severe and life - threatening diseases . They actually represent a significant problem for healthcare facilities and medical attendance. A detailed analysis of the pathogen specific mechanisms of infection is an important prerequisite for the development of novel treatment strategies. S. aureus emploies so-called virulence factors to establish an initially locally limited focus of infection. Depending on the growth phase, adhesins, capsule antigens or toxins are expressed to promote the course of infection. In recent years major progress has been made in the understanding of the regulatory mechanisms of infection in various S. aureus strains. Aim of this thesis was to establish proteomic reference maps of epithelial S9 cells to provide a reference for further investigations of the host-pathogen-interaction. Furthermore, methods studies with S.aureus NCTC8325-4 on a new medium for the co-culture with S9 cells were accomplished. The extracellular proteome of the S. aureus strain RN1GH grown in this optimized medium should be determined for different growth states. Proteomic reference maps were established using two-dimensional polyacrylamide gelelectrophoresis (2D PAGE). Proteins were separated according to their isoelectric point using isoelectric focussing (IPG – strips 24 cm for pI 4-7; 11 cm & 18 cm for pI 6-11) followed by separation by size using SDS polyacrylamide gelelectrophoresis in the second dimension (12.5%, separating range: 20 – 120 kD). Proteins were visualized using various staining methods (silver stain, colloidal Coomassie Brilliant Blue, Flamingo fluorescent stain). Labelled protein spots were sequenced and quantified using MALDI-TOF. Hence proteins were identified by database matching (Mascot 2.0; SwissProt 55.1_human/all) of the isolated sequences. However human S9 cells (CFTR repaired IB3-1) were chosen as a model for bacterial invasion of the respiratory system. They were cultured in MEM supplemented with 4% FCS, 1% non-essential amino acids and 4 mM L-glutamine. The S. aureus strains used were NCTC8325-4 (11-bp deletion in rsbU, cured of three prophages) and RN1HG (rsbU restored) (HG001; Herbert S. et al, 2010). Two proteomic reference maps (pI range 4-7 and 6-11) were constructed for epithelial S9 cells. A total of 668 single proteins could be identified of which 508 had a protein score >55. In addition the proteins were functionally characterized by data base matching (www.pantherdb.org). These maps can now be used to detect proteomic changes during the infection process of S9 cells with S. aureus. To establish an in vitro infection model of S9 cells and S. aureus, a new medium was developed to allow optimal growth conditions for both organisms. After testing various tissue culture media and supplements on S. aureus NCTC8325-4 and comparing its extracellular protein patterns finally MEM supplemented with 2 mM non-essential amino acids was chosen. The S. aureus strain RN1HG was cultured in this medium and a proteomic reference map (pI 4-7) was established for the extracellular proteins. A total of 91 single proteins could be identified of which 48 had a protein score >55. At last proteomic analysis of extracellular fraction were perform for various growth states (exponential, transient, stationary, late stationary) of the bacteria, comparing grown with non-grown cells. During the exponential growth phase, proteins important for colonization (LytM, SAOUHSC_02979, SceD) were induced, while in the stationary phase proteins important for invasion (SsaA, IsaA, SspB) were predominant. Thus, the characteristic expression profiles of the S. aureus strain RN1HG could be verified in the new medium, allowing the use of this strain for in vitro infection models with human S9 epithelial cells (Schmidt F. et al., 2010).

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Metadaten
Author: Delia Letizia Hoppe
URN:urn:nbn:de:gbv:9-000891-2
Title Additional (English):Proteomic analysis of human airway S9 cells and Staphylococcus aureus as a basis for research of host-pathogen interactions
Advisor:Prof. Dr. Uwe Völker
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2011/01/13
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Medizinische Fakultät (bis 2010)
Date of final exam:2010/12/01
Release Date:2011/01/13
Tag:RN1HG, S9-Epithelzellen, extrazellulär
RN1HG, S9 cells, extracellular
GND Keyword:Proteomanalyse, Staphylococcus aureus
Faculties:Universitätsmedizin / Arbeitsgruppe "Funktionelle Genomforschung"
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie