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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002883-4

Characterization of pathologic neutrophil responses and indentification of signaling pathways in HNA-3a antibody-mediated transfusion-related acute lung injury

  • Transfusion-related acute lung injury (TRALI) is an adverse transfusion reaction and the major cause of transfusion-related mortality. The syndrome occurs within six hours after transfusion and is characterized by acute respiratory distress and the occurrence of a non-cardiogenic, bilateral lung edema. TRALI is almost entirely induced by leukocyte-reactive substances which are present in the blood product and get transferred to the recipient during transfusion. The majority of cases (~80%) is caused by leukocyte-reactive immunoglobulins and is accordingly classified as immune-mediated TRALI. The responsible antibodies are generated via alloimmunization and are directed against human leukocyte antigens of class I and II or human neutrophil alloantigens (HNA). Within the HNA class, HNA-3a antibodies have an exceptional clinical relevance as they are most frequently involved in severe and fatal TRALI cases. The high mortality was associated with their characteristic ability to induce a strong neutrophil aggregation response. The described clinical relevance of HNA-3a antibody-mediated TRALI motivates the screening for new strategies for preventive or acute pharmacologic intervention. Knowledge of the molecular pathomechanisms is a crucial prerequisite and thus, respective investigations are required. In order to achieve this goal, HNA-3a antibody-induced cytotoxicity and aggregation were assessed on the molecular level by usage of flow cytometry, the granulocyte agglutination test and by phosphoproteome analysis. The current study provides insight into molecular processes during HNA-3a antibody-induced neutrophil responses and is the first to assess neutrophils using global, gel-free phosphoproteome analyses. Accordingly, it is the first to provide neutrophil phosphoproteome data in the context of TRALI. Gel-free phosphoproteome analyses of primary neutrophils required the highly selective and sensitive phosphopeptide enrichment from stable and sufficiently large protein extracts. However, an appropriate workflow did not exist and was hence developed by sequential protocol optimization steps. The developed workflow was finally proven suitable for comparative gel-free phosphoproteomics when detecting the formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine-induced activation of extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2) signaling in a proof-of-principle experiment. The following single parameter analyses were conducted to investigate neutrophils for their responses to HNA-3a antibodies in absence and presence of proinflammatory priming conditions. Results revealed that the direct stimulation of neutrophils with HNA-3a antibodies will likely not cause the induction of cytotoxic effector functions. In contrast, neutrophils react predominantly by aggregation, a process which is potentially mediated by integrins and causes a secondary, subthreshold activation of solely ERK2. Accordingly, only the neutrophil aggregation response could also be enhanced by an appropriate priming. Taken together, the single parameter analyses proved neutrophil aggregation as the main pathomechanism in HNA-3a antibody-mediated TRALI and thus, the underlying signaling pathways were investigated by global, gel-free phosphoproteomics. The following phosphoproteome analyses indicated the induction of a biphasic signaling during 30 minutes of HNA-3a antibody treatment and signaling pathways of Rho family GTPases could be associated with the first and the second phase. Additionally, the involvement of ERK signaling was indicated in the second phase and this result corroborated thus the data of the previous single parameter analyses. The comprehensive analysis of the identified signaling pathways revealed Rho, Rac and Cdc42 as central regulators and the specific inhibition of Rho in the following validating experiments led very intriguingly to a significant enhancement of HNA-3a antibody-mediated neutrophil aggregation. Hence, this result indicated a potential inhibitory effect of HNA-3a antibodies on Rho activity. Therefore, Rho inhibition was suggested to occur in parallel to an adhesion-inducing signaling pathway and might hence be involved in the stabilization of neutrophil aggregates in HNA-3a antibody-induced TRALI. The results from this doctoral thesis contributed to the generation of a new pathogenesis model for HNA-3a antibody-mediated TRALI. In this model, neutrophils respond to direct HNA-3a antibody exposure predominantly by homotypic aggregation. These potentially very stable and primed aggregates accumulate in the lung and are susceptible to parallel, proinflammatory stimulation. Subsequently, this cascade leads to full neutrophil activation and finally to TRALI induction.
  • Die transfusions-assoziierte akute Lungeninsuffizienz (TRALI) ist eine adverse Transfusionsreaktion und die Hauptursache transfusionsinduzierter Mortalität. Sie manifestiert innerhalb von sechs Stunden nach der Transfusion und ist durch akute Atemnot und ein bilaterales, nicht-kardiogenes Lungenödem gekennzeichnet. Die Induktion der TRALI erfolgt im Rezipienten nahezu ausschließlich durch den transfusionsvermittelten Transfer von leukozytenreaktiven Substanzen aus dem Blutprodukt. Die Mehrheit der Fälle (~80 %) wird durch leukozytenreaktive Immunglobuline ausgelöst und daher als immunogene TRALI klassifiziert. Die verantwortlichen Antikörper (AK) werden durch Alloimmunisierung generiert und reagieren mit humanen Leukozytenantigenen der Klasse I und II oder mit humanen neutrophilen Alloantigenen (HNA). Innerhalb der HNA-Klasse besitzen HNA-3a-AK die höchste klinische Relevanz, da sie am häufigsten in schwere und tödliche TRALI-Fälle involviert sind. Die hohe Mortalität wurde mit ihrer charakteristischen Fähigkeit assoziiert, starke Neutrophilenaggregationen zu induzieren. Die hohe klinische Relevanz der HNA-3a-AK-vermittelten TRALI begründet die Notwendigkeit der Suche nach neuen Präventionsstrategien oder pharmakologischen Interventionsmöglichkeiten in akuten klinischen Situationen. Die Voraussetzung dafür ist die Kenntnis der molekularen Pathogenesemechanismen und entsprechende Untersuchungen sind deshalb von größtem Interesse. Daher erfolgte in dieser Arbeit die Untersuchung der HNA-3a-AK-vermittelten Zytotoxizität und Aggregation auf molekularer Ebene unter Nutzung der Durchflusszytometrie, des Granulozytenagglutinationstests und von Phosphoproteomanalysen. Die vorliegenden Studien geben einen Einblick in molekulare Prozesse während HNA-3a-AK vermittelter Neutrophilenantworten und nutzen erstmalig die globale, gel-freie Phosphoproteomanalyse zur Untersuchung von Neutrophilen. Dementsprechend wurden zum ersten Mal Phosphoproteomdaten von Neutrophilen im Kontext der TRALI erhoben. Die gel-freie Phosphoproteomanalyse von primären Neutrophilen erforderte die hochselektive und sensitive Phosphopeptidanreicherung aus stabilen und ausreichend großen Proteinextrakten. Ein entsprechender Arbeitsablauf existierte jedoch nicht und wurde daher durch sequenzielle Optimierungsversuche entwickelt. Schließlich konnte die Eignung des entwickelten Arbeitsablaufes für vergleichende, gel-freie Phosphoproteomanalysen durch die Detektion der Formyl-Methionyl-Leucyl-Phenylalanin-vermittelten Aktivierung des extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2) Signalwegs demonstriert werden. In den folgenden Einzelparameteranalysen wurden die Reaktionen HNA-3a-AK-behandelter Neutrophiler in Abwesenheit und Gegenwart eines proinflammatorischen Primings untersucht. Die Ergebnisse wiesen darauf hin, dass die direkte Stimulation von Neutrophilen mit HNA-3a-AK höchstwahrscheinlich nicht in der Induktion ihrer zytotoxischen Effektorfunktionen resultiert. Stattdessen reagieren die Zellen hauptsächlich durch Aggregation, ein Prozess der potenziell über Integrine realisiert wird und eine sekundäre, subschwellige Aktivierung von ERK2 zur Folge hat. Dementsprechend konnte auch lediglich die Neutrophilenaggregation durch adäquates Priming verstärkt werden. Zusammengefasst wiesen diese Analysen auf die Neutrophilenaggregation als wesentlichen Pathogenesemechanismus in der HNA-3a-AK-vermittelten TRALI hin und daher wurden die zugrunde liegenden Signaltransduktionsmechanismen nachfolgend in globalen, gel-freien Phosphoproteomanalysen untersucht. Die Phosphoproteomanalysen deuteten auf die Induktion eines biphasischen Signalwegs über 30 Minuten der HNA-3a-AK-Behandlung hin und Signalwege der Rho-Familie GTPasen konnten mit der 1. und 2. Phase assoziiert werden. Zusätzlich konnte die Beteiligung des ERK Signalweges in der 2. Phase abgeleitet und somit das Ergebnis der Einzelparameteranalysen bestätigt werden. Die eingehende Analyse der identifizierten Signalwege zeigte Rho, Rac und Cdc42 als Hauptregulatoren und die spezifische Inhibition von Rho in den nachfolgenden Validierungsexperimenten führte interessanterweise zur signifikanten Verstärkung der HNA-3a-AK-vermittelten Neutrophilenaggregation. Dieses Ergebnis deutete somit einen potenziell inhibitorischen Effekt der HNA-3a-AK auf die Rho Aktivität an. Demnach verläuft die Rho Inhibition möglicherweise parallel zur adhäsionsinduzierenden Kaskade und könnte daher die Stabilisierung der Neutrophilenaggregate in der HNA-3a-AK-induzierten TRALI vermitteln. Die Ergebnisse dieser Dissertation trugen zur Erstellung eines neuen Pathogenesemodells der HNA-3a-AK-vermittelten TRALI bei. In diesem reagieren Neutrophile hauptsächlich durch die homotypische Aggregation auf die direkte Stimulation mit HNA-3a-AK. Diese potenziell stabilen und geprimten Aggregate akkumulieren in der Lunge und durch deren volle Aktivierung über parallele, proinflammatorische Prozesse kommt es zur Entstehung der TRALI.

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Metadaten
Author: Stefan Muschter
URN:urn:nbn:de:gbv:9-002883-4
Title Additional (German):Charakterisierung von pathologischen Neutrophilenantworten und Identifikation von Signalwegen in der HNA-3a Antikörper-vermittelten transfusionsassoziierten akuten Lungeninsuffizienz.
Advisor:Prof. Dr. Andreas Greinacher, Prof. Dr. Uwe Völker
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2017/10/17
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2017/09/29
Release Date:2017/10/17
Tag:Phosphoproteomanalyse
GND Keyword:Neutrophiler Granulozyt, Phosphorylierung, Signaltransduktion, Transfusionsassoziiertes akutes Lungenversagen
Faculties:Universitätsmedizin / Arbeitsgruppe "Funktionelle Genomforschung"
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie