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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002690-7

Funktionelle Charakterisierung der Isoform 1 des TPD52-Proteins in einem Zellkulturmodell zum kastrationsresistenten Prostatakarzinom

  • Eine häufig therapiebedingte Spätkomplikation beim Prostatakarzinom ist die Ausprägung einer Kastrationsresistenz. Diese zeichnet sich durch eine von Androgenen unabhängige Progression aus. Die Therapieoptionen in diesem Stadium sind begrenzt und die Prognose ist ungünstig. Als eine Ursache wird die hormonunabhängige Aktivierung des Androgenrezeptors diskutiert. Ein weiterer Mechanismus ist die Entstehung neuroendokrin-differenzierter Tumorzellen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle eines Proteins der TPD52-Familie bei diesen Prozessen untersucht. Durch alternatives Spleißen entstehen vom TPD52-Gen verschiedene Transkriptvarianten. Neben der ubiquitär vorkommenden Isoform 3 lag der Fokus dieser Arbeit auf der prostataspezifischen Isoform 1, hier als PC-1 (prostate and colon gene 1) bezeichnet. Beide Isoformen sind mit der Progression des Prostatakarzinoms assoziiert, scheinen in diesem Kontext jedoch unterschiedliche Funktionen zu haben. Um speziell PC-1 untersuchen zu können, wurde ein rekombinant hergestelltes Antigen erfolgreich zur Gewinnung eines spezifischen Antikörpers verwendet. Zur funktionellen Charakterisierung von PC-1 wurde auf Basis der Prostatakarzinomzelllinie LNCaP ein Zellkulturmodell etabliert, welches eine induzierbare Überexpression dieses Proteins ermöglicht. Unter Verwendung dieser Zelllinie konnte gezeigt werden, dass PC-1 die Zellviabilität unter Androgenablation und während der Behandlung mit dem Antiandrogen Flutamid steigert. Zudem fördert PC-1 die Translokation des Androgenrezeptors in den Zellkern. Durch Androgenablation oder eine Kultivierung in Gegenwart des Zytokins IL-6 lassen sich Prostatakarzinomzellen in Richtung eines neuroendokrinen Phänotyps differenzieren. Diese Differenzierung korreliert unter anderem mit charakteristischen Veränderungen der Zellmorphologie. In dieser Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass die Behandlung mit IL-6 zu einer signifikanten Überexpression von PC-1 führt. Andere TPD52-Isoformen werden nicht beeinflusst. Den größten Effekt auf eine neuroendokrine Differenzierung zeigte eine Kombination aus IL-6-Behandlung und PC-1-Überexpression. Dieser konnte durch Western-Blot-Analysen, Immunfluoreszenzfärbungen, live cell imaging sowie über den RT-qPCR-basierten Nachweis einer vermehrten Expression neuronaler Marker validiert werden. Des Weiteren zeigten neuroendokrin-differenzierte LNCaP-Zellen nach PC-1-Überexpression eine erhöhte Zellviabilität, vermutlich durch eine gesteigerte Expression und Aktivität des Androgenrezeptors. Darüber hinaus konnte demonstriert werden, dass sich das Wachstum undifferenzierter LNCaP-Zellen durch die Präsenz neuroendokrin-differenzierter Zellen fördern lässt. Dieser Effekt war sogar unter Androgenablation deutlicher als in androgenhaltigem Medium und ist vermutlich auf sezernierte Mediatoren zurückzuführen, die das Medium entsprechend konditioniert haben. Um die Beteiligung von PC-1 an sekretorischen Vorgängen besser zu verstehen, wurden potentielle Interaktionspartner identifiziert. Speziell für die Kinesine KLC1/2 und UKHC ergaben sich Hinweise auf eine Wechselwirkung mit PC-1. Neben konfokalmikroskopisch analysierten Kolokalisationen konnten Interaktionen mittels Co-Immunpräzipitationen bestätigt werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit verdeutlichen, dass PC-1 die Progression des Prostatakarzinoms über verschiedene Mechanismen beeinflusst. Somit kann PC-1 als ein bedeutsames, therapeutisches Zielprotein betrachtet werden.
  • In the present work, we investigated the role of isoform 1 of the TPD52 protein family (PC-1) in the development of castration resistant prostate cancer. In order to examine specifically PC-1, a recombinantly produced antigen was successfully used to obtain a specific antibody. For the functional characterization of PC-1, a cell culture model was established based on the prostate carcinoma cell line LNCaP, which allows an inducible overexpression of this protein. Using this cell line, it was shown that PC-1 increases cell viability under androgen ablation and during treatment with the antiandrogen flutamide. In addition, PC-1 promotes the translocation of the androgen receptor in the cell nucleus. By androgen ablation or cultivation in the presence of the cytokine IL-6, prostate carcinoma cells can be differentiated in the direction of a neuroendocrine phenotype. This differentiation correlates with characteristic changes in cell morphology. In this work it was shown for the first time that treatment with IL-6 leads to a significant overexpression of PC-1. Other TPD52 isoforms are not affected. The greatest effect on neuroendocrine differentiation was demonstrated by a combination of IL-6 treatment and PC-1 overexpression. This was validated by Western blot analyzes, immunofluorescence staining, live cell imaging, and RT-qPCR-based detection of increased expression of neuronal markers. Furthermore, neuroendocrine-differentiated LNCaP cells showed increased cell viability after PC-1 over-expression, presumably by increased expression and activity of the androgen receptor. In addition, it was demonstrated that the growth of undifferentiated LNCaP cells can be promoted by the presence of neuroendocrine differentiated LNCaP cells. This effect was even more pronounced under androgen ablation than in androgen-containing medium and is presumably due to secreted mediators that have conditioned the medium. In order to understand the involvement of PC-1 in secretory processes, potential interaction partners were identified. Especially for the kinesines KLC1/2 and UKHC there were indications for an interaction with PC-1. In addition to colocalizations analyzed by confocal microscopy, interactions could be confirmed by co-immunoprecipitations. The results of this work demonstrate that PC-1 influences the progression of prostate cancer by different mechanisms. Thus, PC-1 can be considered as a significant therapeutic target protein.

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Metadaten
Author: Tom Moritz
URN:urn:nbn:de:gbv:9-002690-7
Title Additional (English):Functional characterization of the isoform 1 of the TPD52 protein in a cell culture model for the castration resistant prostate cancer
Advisor:Prof. Dr. Reinhard Walther
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2017/01/03
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2016/12/20
Release Date:2017/01/03
Tag:Kinesine, Neuroendokrine Differenzierung, PC-1, TPD52
PC-1, castration resistant prostate cancer, neuroendocrine differentiation
GND Keyword:Androgen-Rezeptor, Hormonresistentes Prostatakarzinom
Faculties:Universitätsmedizin / Institut für Med. Biochemie u. Molekularbiologie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie