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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002516-5

Comparative proteome analyses of Staphylococcus aureus strains and their isogenic mutants in vitro and in host-pathogen interactions

  • Staphylococcus aureus can be a harmless colonizer of the human body, which colonizes about 20-30% of the population. If S. aureus overcomes the outer physical barrier of the body, comprised of the skin and mucous surfaces, it can also cause severe diseases such as endocarditis, pneumonia, or sepsis. S. aureus possesses a variety of secreted and surface bound virulence factors to mediate attachment and invasion into the host, to disseminate an infection and to modulate and evade the immune system. But not only the huge amount of virulence factors turn S. aureus into a dangerous human pathogen, also its resistances to a broad spectrum of commonly used antibiotics make infections hard to treat. During the last years it became apparent that S. aureus can be internalized by as well as replicate and persist in professional and non-professional phagocytic cells. It is suggested that the intracellular compartment protects S. aureus from antibiotic treatment and the immune system. To accomplish the adaptation to the intracellular compartment, S. aureus needs to regulate its gene expression by regulatory systems. One of these regulators is the alternative sigma factor SigB, which directly and indirectly regulates the expression of about 200 genes in vitro. However, the stimuli leading to the activation of SigB in S. aureus are barely known and also its role during an infection varies, depending on the S. aureus strain and infection model used. Therefore, the importance of SigB during the early adaption of S. aureus to the intracellular environment should be elucidated using a cell culture infection model. First, the existing cell culture infection workflow had to be modified to improve the data analysis and to increase the yield of identified proteins to comparatively monitor the adaption reaction of S. aureus HG001 and its isogenic ΔsigB mutant to the intracellular milieu of S9 human bronchial epithelial cells. The proteome analysis in conjunction with RT-qPCR analysis of the wild type and the ΔsigB mutant revealed a fast and transient activation of SigB directly after internalization. Quantitative analysis of the intracellular bacterial titer demonstrated a requirement of SigB for intracellular replication. Differences in the proteome composition of the ΔsigB mutant in comparison to the wild type after internalization reflected the different growth rates, resistance to antibiotics and toxic compounds, adaptation to oxidative stress, and protein quality control mechanisms. The accessory gene regulator (Agr) is like SigB also a global regulator of gene expression in S. aureus. To elucidate possible benefits in the intracellular survival of the co-occurrence of S. aureus wild type and Δagr mutant cells, like it can be found in sites of an infection, a co-infection assay was established. With the co-infection assay the simultaneous and competitive intracellular survival in comparison to the individual intracellular survival was followed for three days post-infection (p.i.). The single and the co-infection revealed that the wild type was able to replicate more efficiently during the first hours p.i. than the Δagr mutant, but the mutant was able to survive more efficiently. The extracellular proteome of S. aureus represents the key compartment for virulence factors. Virulence factors are secreted or bound to the surface of the S. aureus cell. With the infection workflow applied in this study, secreted proteins are lost during the enrichment of the intracellular bacteria for proteome analysis. Therefore, no information about the levels or the regulation of virulence factor expression can be acquired in the cell culture infection model using cell sorting approaches. Hence, the extracellular proteome of S. aureus was analyzed in vitro from shake flask experiments. To get a comprehensive overview of the regulatory impact of different global regulators onto the secretome, S. aureus LS1 mutants lacking the global regulators Agr, SarA and SigB were compared to the respective wild type. Additionally the protein level of the secretome of the well characterized and frequently used S. aureus strains 6850, CowanI, HG001, LS1, SH1000, and USA300 was comparatively analyzed. This project was performed in collaboration with the group of Prof. Löffler from the Institute of Medical Microbiology in Jena. The data of the extracellular proteome generated in this thesis were combined with phenotypic and toxicity data to explain strain differences in invasiveness, cytotoxicity, phagosomal escape, and intracellular persistence in infection experiments.
  • Staphylococcus aureus ist ein harmloser Kommensale des Körpers, welcher 20-30% der Bevölkerung besiedelt. Falls S. aureus die physikalische Barriere des Körpers überwindet, kann es auch schwere Erkrankungen wie Endokarditis, Lungenentzündung oder Sepsis auslösen. S. aureus besitzt eine Vielzahl von sekretierten und Oberflächen-gebundenen Virulenzfaktoren um sich an den Wirt anzuheften und in ihn einzudringen, eine Infektion zu verursachen und um das Immunsystem zu umgehen. Jedoch sind es nicht nur die Virulenzfaktoren, die S. aureus zu einem gefährlichen human pathogenen Erreger machen, auch seine Resistenzen gegenüber fast allen häufig verwendeten Antibiotika erschweren die Behandlung von S. aureus ausgelösten Infektionen. Im Verlauf der letzten Jahre wurde es offensichtlich, dass S. aureus von profesionell und nicht-professionell phagozytierenden Zellen aufgenommen wird und sich in ihnen vermehren und persistieren kann. Es wird vermutet, dass der intrazelluläre Raum dem Bakterium Schutz vor Antibiotika und dem Immunsystem bietet. Um sich an die intrazelluläre Umgebung anzupassen, muss S. aureus seine Genexpression durch regulatorische Systeme regulieren. Einer dieser Regulatoren ist der alternative Sigmafaktor SigB, welcher direkt und indirekt die Expression von ca. 200 Genen in vitro kontrolliert. Jedoch sind die Reize, die zu einer Aktivierung von SigB in S. aureus führen bisher kaum bekannt und auch die Aufgabe von SigB wärend einer Infektion variiert mit dem verwendeten S. aureus Stamm und Infektionsmodel. Daher sollte die Bedeutung von SigB während der frühen Anpassungsphase von S. aureus an die intrazelluläre Umgebung in einem Zellkultur Infektionsmodel untersucht werden. Zunächst musste das bestehende Protokoll der Infektionsexperimente angepasst werden, um die Datenauswertung zu verbessern und die Ausbeute identifizierter Proteine zu erhöhen, um anschließend die Anpassung von S. aureus HG001 und seiner isogenen ΔsigB Mutante an das intrazelluläre Milieu von S9 humanen bronchialen Epithelzellen zu untersuchen. Die Proteomanalyse in Verbindung mit einer RT-qPCR Analyse des Wildtyps und der ΔsigB Mutante ergab, dass SigB direkt nach der Internalisierung schnell und transient aktiviert wurde. Die quantitative Bestimmung des intrazellulären bakteriellen Titers zeigte, dass SigB für eine erfolgreiche intrazelluläre Vermehrung vorhanden sein muss. Unterschiede der Proteinmengen in der ΔsigB Mutante im Vergleich zum Wildtyp nach der Internalisierung reflektierten das unterschiedliche Wachstumsverhalten, die Resistenz gegenüber Antibiotika und toxischer Verbindungen, die Anpassung an oxidativen Stress und Mechanismen für die Qualitätskontrolle von Proteinen. Der „accessory gene regulator“ (Agr) ist wie SigB ein globaler Regulator der Genexpression in S. aureus. Um mögliche Vorteile des gemeinsamen Vorkommens, wie es auch in Infektionen beobachtet werden kann, eines S. aureus Wildtypen und einer Δagr Mutante für das intrazelluläre Überleben zu beleuchten wurde ein Protokoll für ein Koinfektionsexperiment etabliert. Mit Koinfektionsexperimenten wurde das gleichzeitige intrazelluläre Überleben im Vergleich zum einzelnen intrazellulären Überleben drei Tage lang verfolgt. Die Einzel- und die Koinfektionen haben gezeigt, dass der Wildtyp in den ersten Stunden nach der Infektion in der lage ist sich effizienter zu vermehren als die Δagr Mutante. Jedoch konnte die Δagr Mutante drei Tage nach der Infektion in höheren Zellmengen überleben. Die meisten Virulenzfaktoren von S. aureus sind im extrazellulären Proteom zu finden, da sie entweder sekretiert werden oder an die Zelloberfläche gebunden sind. In dem in dieser Arbeit angewandten experimentellen Ablauf gehen sekretierte Proteine während der Anreicherung der intrazellulären Bakterien für anschließende Proteomanalysen verloren. Daher kann durch die Infektionsexperimente, in denen die Bakterien über Zellsortierungen angereichert werden, keine Informationen über die Mengen der Virulenzfaktoren oder ihre Regulation gesammelt werden. Deshalb wurde das extrazelluläre Proteom von S. aureus in in vitro Experimenten untersucht. Um einen umfassenden Überblick über das Sekretom zu erhalten, wurden S. aureus LS1 Mutanten, in denen die Gene für die globalen Regulatoren Agr, SarA und SigB deletiert wurden, im Vergleich zum Wildtyp analysiert. Zusätzlich wurden die Proteinmengen des Sekretoms der gut charakterisierten und häufig verwendeten S. aureus Stämme 6850, CowanI, HG001, LS1, SH1000 und USA300 vergleichend untersucht. Dieses Projekt wurde in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Prof. Löffler des Instituts für Medizinische Mikrobiologie in Jena durchgeführt. Die Daten des extrazellulären Proteoms konnten wichtige Erkenntnisse über die S. aureus Stämme beitragen, um Unterschiede in durchgeführten Infektionsexperimenten betreffend ihrer Invasivität, dem Auslösen von Zelltod, dem Ausbruch aus den Phagosomen und in ihrer intrazellulären Persistenz zu erklären.

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Metadaten
Author: Henrike Pförtner
URN:urn:nbn:de:gbv:9-002516-5
Title Additional (German):Vergleichende Proteom-Studien von Staphylococcus aureus Stämmen und ihren isogenen Mutanten in vitro und im Zusammenspiel von Wirt und Erreger
Advisor:Prof. Dr. Uwe Völker
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2016/05/09
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2016/04/20
Release Date:2016/05/09
Tag:Epithelzellen, Internalisierung, Wirt-Erreger Interaktionen
epithelial cells, host-pathogen interactions, internalization
GND Keyword:Infektion, Proteomics, Staphylococcus aureus
Faculties:Universitätsmedizin / Arbeitsgruppe "Funktionelle Genomforschung"
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie