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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002664-2

Proteomic analysis of endomyocardial biopsies and plasma of dilated cardiomyopathy patients treated by immunoadsorption therapy

  • Dilated cardiomyopathy (DCM) is a myocardial disorder characterised by ventricular dilation with reduced left ventricular ejection fraction (LVEF). Immunoadsorption (IA) followed by immunoglobulin (IgG) substitution (IA/IgG) has been shown to be a promising therapeutic intervention to recover myocardial functions in DCM patients. The beneficial effects of IA/IgG therapy are associated with increased LVEF, decreased left ventricular inner diameter at diastole (LVIDd) and reduced myocardial inflammation. Despite knowing the cardiac benefits of IA/IgG, the precise molecular mechanism induced by therapy is still elusive. Additionally, only ≈60 % DCM patients treated with IA/IgG demonstrated improved heart function. Moreover, the reasons for this differential outcome among DCM patients after treatment have not been clearly understood. In this study, efforts were made to uncover the therapy induced proteomic changes in the heart of responders (relative change in LVEF ≤ 20%, LVEF < 5% absolute value) and non-responders using a global proteomic approach. Apart from it, proteomic profiling of endomyocardial biopsies and plasma was performed to find protein biomarker candidates which might be useful to distinguish responder and non-responder DCM patients before immunoadsorption therapy and support a selective and individualized treatment. To reveal therapy induced myocardial proteomic changes, endomyocardial biopsies of DCM patients before and after therapy were compared. LVEF increased (32 ± 8 to 45±7, p<0.002) and LVIDd decreased (66 ± 6 to 60±6, p<0.040) after therapy in responders, whereas non-responders did not show any significant changes in these clinical parameters. To address the changes in the myocardial proteome induced by therapy, a label-free proteomic approach was applied. The most prominent proteomic differences between both subgroups were observed in cytoskeletal, fibrosis, and extracellular matrix proteins. Therapy linked benefit in responders seems to be highly associated with the lower abundance of fibrotic and extracellular matrix proteins which seems to reflect a lower activity of transforming growth factor-β signaling. To elucidate proteomic differences between responders and non-responders at baseline, endomyocardial biopsies and plasma proteome profiling were performed. Responder and non-responder DCM patients did not show any significant differences in the clinical parameters (LVEF, LVIDd, age, inflammation, etc.) before IA/IgG therapy except for disease duration that was in tendency higher among non-responders. Proteomics profiling of endomyocardial biopsies revealed 54 differentially abundant proteins between responders and non-responders. Among those proteins, Protein S100-A8 and kininogen-1 was found higher whereas perilipin-4 was found lower abundant in responders. Plasma profiling of these subgroups revealed five proteins (S100-A8, S100-A9, C-Reactive protein, lipopolysaccharide-binding protein, and cysteine-rich secretory protein) displaying strong discriminative power between responders and non-responders. Higher abundance of Protein S100-A8 was observed in myocardium as well as in plasma among responders. Protein S100-A8 might be a potential candidate to distinguish responders and non-responders at baseline, and its potential utility at clinical levels must be evaluated. The last objective of the thesis was to establish a workflow for the relative quantitation of phosphopeptides for samples generally obtained in small amounts like myocardial biopsies. To address this question, optimization was performed with HL-1 cardiomyocytes using a PolyMAC phosphopeptide enrichment kit and the effect of TGF-β1 on the phosphoproteome was evaluated as a proof-of-principle study. Using only 200µg protein of each sample up to 2000 phosphopeptides with an efficiency of >90 percent could be covered. In total, upon TGF-β1 incubation alterations of 214, 92, and 53 phosphopeptides were observed after 1, 6 and 24 hours, respectively. Differentially altered phosphopeptides belonged to many signaling pathways including the ubiquitin-proteasome pathway, cytoskeletal regulation by Rho GTPase, calcium signaling, and TGF-β signaling. Thus, in this study a workflow for relative quantitation of phosphopeptides was established that may be later applied to precious biopsy samples. Along with this, TGF- β1 induced phosphoproteome was analysed in HL-1 cardiomyocytes.
  • Die dilatative Kardiomyopathie (DCM) ist eine Myokarderkrankung, die durch eine ventrikuläre Erweiterung bei gleichzeitig verringerter linksventrikulärer Auswurffraktion (LVEF) charakterisiert ist. Eine Immunadsorptionstherapie mit nachfolgender Substitution der Immunglobuline (IA/IgG), führt zu einer Verbesserung der hämodynamischen Funktion, einem verringertem linksventrikulärem diastolischen Durchmesser (LVIDd), sowie einem geringerem Inflammationsgrad in DCM Patienten. Die der verbesserten Hämodynamik nach IA/IgG Therapie zugrunde liegenden molekularen Mechanismen sind jedoch weitestgehend unbekannt. Zudem profitieren nur etwa 60% der IA/IgG behandelten DCM Patienten, wobei die Ursache der unterschiedlichen Effekte noch unklar ist. Ein Schwerpunkt dieser Studie bildete daher die globale Proteinanalyse der durch IA/IgG Therapie vermittelten Änderungen in Respondern (relative Änderung der LVEF ≤ 20%, LVEF < 5% absolute) und Nonrespondern. Darüber hinaus wurden Proteinanalysen sowohl von endomyokardialen Biopsien als auch von Blutplasma erstellt, um potentielle Proteinbiomarker zu definieren, welche eine Unterscheidung von DCM Patienten bereits vor Therapiebeginn hinsichtlich ihres Therapieerfolges ermöglichen und somit eine optimierte, individuelle Behandlung unterstützen. Zur Analyse Therapie-induzierter Änderungen myokardialer Proteine wurden humane Biopsien vor und nach Therapie verglichen. Die klinischen Parameter der Responder zeigten nach Therapie einen Anstieg der LVEF (32 ± 8 to 45±7, p<0.002) und eine Verringerung des LVIDd (66± 6 to 60±6, p<0.040), während die Gruppe der Nonresponder keine signifikanten Änderungen dieser Parameter zeigte. Um die Änderungen myokardialer Proteine nach Therapie zu adressieren, wurde ein Label-freier Proteomansatz angewandt. Es wurden signifikante Unterschiede zwischen den Subgruppen für Proteine des Zytoskeletts, der extrazellulären Matrix, als auch für Fibrose-assoziierte Proteine erfasst. Darüber hinaus wurden globale Proteomanalysen von endomyokardialen Biopsien und Plasma durchgeführt, um Unterschiede in der Proteinabundanz zwischen Respondern und Nonrespondern vor IA/IgG Therapie zu adressieren. Responder und Nonresponder zeigten keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich klinischer Parameter (LVEF, LVIDd, Alter, Inflammations, etc.) vor Therapiebeginn. Jedoch zeigte die Gruppe der Nonresponder einen tendenziell längeren Krankheitszeitraum. Das Proteinprofil endomyokardialer Biopsien ergab 54 Proteine, die eine unterschiedliche Abundanz in Respondern und Nonrespondern zeigten. Unter diesen Proteinen wurden S100-A8 und Kininogen-1 in erhöhter Menge, und Perilipin 4 in geringerer Menge in Respondern detektiert. Die Plasmaproteinanalyse der Patientengruppen ergab fünf Proteine (S100-A8, S100-A9, C-Reactive Protein, Lipopolysacharid-Bindeprotein und Cystein-rich secretory Protein) die stark diskriminierend für die Unterscheidung von Respondern und Nonrespondern vor IA/IgG Therapie waren. Die höhere Abundanz des Protein S100-A8 in Respondern konnte, sowohl im Myokard, als auch im Plasma, nachgewiesen werden. Das Protein S100-A8 ist somit ein potentieller Kandidat für die Unterscheidung von Respondern und Nonrespondern vor IA/IgG Therapie, wobei die Relevanz im klinischen Bereich evaluiert werden muss. Das letzte Ziel der Arbeit war es, einen Arbeitsablauf für die relative Quantifizierung von Phosphopeptiden aus Proben mit geringer Proteinmenge, wie es für Myokardbiopsien zutrifft, zu etablieren. Um diese Aufgabe zu lösen, wurde die Optimierung mit HL-1 Kardiomyozyten unter Verwendung des PolyMAC-Phosphopeptidanreicherungskits durchgeführt. Hierbei wurde in einer Vorstudie die Wirkung von TGF-β1 auf das Phosphoproteom untersucht. Mit nur 200 μg Proteinen jeder Probe konnten bis zu 2000 Phosphopeptide mit einem Wirkungsgrad von über 90 Prozent abgedeckt werden. Insgesamt wurden bei TGF-β1-Inkubationen nach 1, 6 und 24 Stunden die Veränderungen von 214, 92 und 53 Phosphopeptiden beobachtet. Differenziell veränderte Phosphopeptide gehörten zu vielen Signalwegen, wie dem Ubiquitin-Proteasom-Weg, der Zytoskelett Regulation durch Rho-GTPasen, dem Calcium-Signalweg und dem TGF-β-Signalweg. Somit wurde in dieser Arbeit ein Arbeitsablauf zur relativen Quantifizierung von Phosphopeptiden etabliert, welcher später auf kostbare Biopsie Proben angewendet werden kann. Zusätzlich dazu konnte die TGF-β1 induzierte Veränderung des Phosphoproteoms in HL-1-Kardiomyozyten analysiert werden.

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Metadaten
Author: Gourav Bhardwaj
URN:urn:nbn:de:gbv:9-002664-2
Title Additional (German):Proteinanalysen von endomyokardialen Biopsien und Blutplasma aus Patienten mit dilatativer Kardiomyopathie vor und nach Immunadsorptionstherapie
Advisor:Prof. Dr. Uwe Völker
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2016/11/21
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2016/11/17
Release Date:2016/11/21
Tag:dilatative Kardiomyopathie
Dilated cardiomyopathy, Imunoadsorption therapy, proteomics
GND Keyword:Endomyokardbiopsien und Plasma, Immunoadsorptionstherapie, Proteomik, Responder und Nicht-Responder, dilatative Kardiomyopathie
Faculties:Universitätsmedizin / Arbeitsgruppe "Funktionelle Genomforschung"
DDC class:600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften / 610 Medizin und Gesundheit