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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-000621-3

Rekombinante Expression, Reinigung und Charakterisierung der neuralen Zellerkennungsmoleküle P0 und L1

  • Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit war die rekombinante Expression und Reinigung der extrazellulären Domänen der neuralen Zellerkennungsmoleküle P0 und L1. Die gereinigten Proteine sollten für Strukturanalysen verwendet werden. Da es sich sowohl bei P0 als auch bei L1 um Glykoproteine handelt, wurde die rekombinante Expression in eukaryotischen Systemen durchgeführt. Die extrazelluläre Domäne des Zelladhäsionsmoleküls L1 wurde als Fusionsprotein (L1-TEV-Fc) mit einem durch TEV-Protease spaltbaren Fc-Tag in CHO-Zellen exprimiert, die das L1-TEV-Fc in den Zellkulturüberstand sezernierten. Das L1- TEV-Fc konnte erfolgreich über eine Protein A-Säule aufgereinigt werden. Seine biologische Aktivität wurde in einem Neuritenwachstums-Assay nachgewiesen. Um strukturelle Analysen an der extrazellulären Domäne durchführen zu können, sollte der Fc-Tag mit der TEV-Protease abgespalten werden. Obwohl verschiedene Reaktionsparameter wie Temperatur, Inkubationszeit, Konzentration der TEVProtease und die Konzentration der Detergenzien variiert wurden, war eine Spaltung des L1-TEV-Fc im Rahmen dieser Arbeit nicht möglich. Das Zellerkennungsmolekül P0 ist das häufigste Protein im Myelin des peripheren Nervensystems. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte neben der wildtypischen auch eine mutierte Form der extrazellulären Domäne des P0-Proteins in Pichia pastoris exprimiert werden. Die mutierte Form des P0-Proteins enthielt einen Aminosäureaustausch an Position 106 von Isoleucin zu Leucin (Ile106Leu), welcher beim Menschen zu einer schweren Form der Charcot-Marie-Tooth’schen Krankheit vom Typ 1B führt. Sowohl die wildtypische als auch die Ile106Leu-Form der extrazellulären Domäne des P0-Proteins konnten in Pichia pastoris exprimiert werden, und wurden als Fusionsproteine mit einem Myc- und einem sechsfachen Histidin-Tag in den Überstand sezerniert. Die Aufreinigung erfolgte über Ni-NTA-Agarose-Beads. Durch eine Fermentation im 35 l-Maßstab konnten beide Fusionsproteine für strukturelle Analysen in größerer Menge produziert und aufgereinigt werden. Eine anschließende Analyse mittels Dynamischer Laserlichtstreuung (DLS) zeigte, dass die Voraussetzungen für die Durchführung eines Kristallisationsscreens mit 480 Bedingungen gegeben waren. Durch Deglykosylierung mit N-Glykosidase F und 1D-NMR-Spektroskopie konnte gezeigt werden, dass die extrazelluläre Domäne des wildtypischen P0-Proteins aus Pichia pastoris glykosyliert ist. Eine Hyperglykosylierung konnte ausgeschlossen werden. Neben dem Einfluss der Ile106Leu-Mutation auf die Struktur der extrazellulären Domäne wurde auch ihr Einfluss auf die homophile Interaktion des P0-Proteins untersucht. In einem Aggregations-Assay mit transient transfizierten CHO-Zellen konnte gezeigt werden, dass die Zellen, die das wildtypische P0 voller Länge exprimierten, im Verhältnis zu P0-Ile106Leu-exprimierenden Zellen stärker aggregierten. Die Ile106Leu-Mutation wirkt sich also offenbar negativ auf die homophile Interaktion des P0-Proteins aus.
  • This thesis was focused on the recombinant expression and purification of the extracellular domains of the neural cell adhesion molecules P0 and L1. The purified proteins should be used for structural analyses. As both P0 and L1 are glycoproteins, recombinant expression was carried out in eukaryotic systems. The L1 extracellular domain was expressed and secreted as a fusion protein (L1- TEV-Fc) with the TEV protease-cleavable Fc tag by CHO cells. The L1-TEV-Fc could be purified using a protein A column. The biological activity of this fusion protein was confirmed by measuring its neurite outgrowth-promoting effect. To perform structural analysis on the extracellular domain of L1, removal of the Fc tag by TEV protease cleavage was required. Although several parameters were variegated in the enzymatic reaction, including incubation time, temperature, protease concentration, and concentration of detergents, no cleavage of L1-TEV-Fc by TEV protease was observed. The cell recognition molecule P0 is the most abundant protein of peripheral myelin. One aim of the present study was to express both the wild-type and a mutant form of the extracellular domain of P0 in Pichia pastoris. The mutant version of the P0 protein carried an amino acid exchange from isoleucin to leucin at position 106 (Ile106Leu) which causes a severe form of Charcot-Marie-Tooth disease type 1B in humans. Both proteins were expressed and secreted as fusion proteins with a myc tag and a six-fold histidin tag. The purification was carried out using Ni-NTA agarose beads. A fermentation in a 35 l scale was performed for each protein, as large amounts of purified protein were needed for structural analyses. After purifying and concentrating, a dynamic laserlight scattering (DLS) was performed to ascertain that both proteins were present in a sufficient form for crystallization. As both the extracellular domain of wild-type P0 and the ectodomain of P0 Ile106Leu fulfilled this condition, a screen of 480 crystallisation conditions could be performed. The extracellular domain of wild-type P0 was further analysed by 1D-NMR spectroscopy and deglycosylation with N-Glycosidase F. Both experiments confirmed that the P0 was glycosylated by Pichia pastoris, and a hyperglycosylation by the yeast could be excluded. Apart from analysing the influence of the Ile106Leu mutation on the structure of the extracellular domain, the present study aimed at studying its influence on the homophilic interaction of P0. Therefore, an aggregation assay with transiently transfected CHO cells was performed. CHO cells expressing the full-length wild-type P0 aggregated more strongly than cells expressing the full-length P0 Ile106Leu. This finding suggests that the Ile106Leu mutation has a negative effect on the homophilic interaction of P0.

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Metadaten
Author: Isabel Köhlitz
URN:urn:nbn:de:gbv:9-000621-3
Title Additional (English):Recombinant expression, purification, and characterisation of the neural cell adhesion molecules P0 and L1
Advisor:Prof. Dr. Reinhard Walther
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2009/05/27
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2009/04/08
Release Date:2009/05/27
GND Keyword:CHO-Zelle, Heterologe Genexpression, Neurobiologie, Pichia pastoris
Faculties:Universitätsmedizin / Institut für Med. Biochemie u. Molekularbiologie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie