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Untersuchungen zur Aufklärung der molekularen Ursachen erblich bedingter Erkrankungen des zentralen Nervensystems

  • Geistige Behinderung ist eine der häufigsten Formen von erblich bedingten kognitiven Beeinträchtigungen. Definiert wird sie durch einen Intelligenzquotienten unter 70 und obwohl ihre genetischen Ursachen sehr heterogen sein können, gibt es unter ihnen eine beachtliche Menge Gene, die am Aufbau der Glycocalyx beteiligt sind [1, 2]. Die Glycocalyx besteht aus Zuckerbausteinen, die Teil von Lipiden und Proteinen der Zelloberfläche oder der extrazellulären Matrix sind. Vor kurzem konnten wir belegen, dass Mutationen im ST3GAL3-Gen, welches für die Golgi-lokalisierte β-Galactosid-α2,3-sialyltransferase-III codiert, zu verschiedenen klinischen Befunden führt. Zwei unabhängige Mutationen (p.Ala13Asp and p.Asp370Tyr), gefunden in iranischen Familien, konnten mit relativ milden Formen nicht-syndromaler geistiger Behinderung (NSARID) in Verbindung gebracht werden [5]. Eine dritte Punktmutation (p.Ala320Pro), gefunden in einer palästinensischen Familie, verursachte hingegen eine schwere, altersabhängige epileptische Enzephalopathie, das West-Syndrom. Dieses Syndrom ist mit einem Arrest der geistigen Entwicklung oder sogar, wie in unserem Fall, einer Regression assoziiert [3, 4]. ST3GAL3 bildet im Menschen unter anderem das Sialyl Lewis-a (sLea)-Epitop auf Proteinen. Exogene Expression der Volllängen-c-MYC-Fusionsproteine, der Mutationsvarianten in LMTK—Zellen, zeigte, dass alle Varianten eine gestörte subzellulare Lokalisierung zeigen und zwei von ihnen (p.Ala13ASp und p.ALA320Pro) kaum mehr messbare Aktivität besitzen [5]. Um die molekularen und zellulären Mechanismen näher zu beleuchten, die dem ST3GAL3-bedingten West-Syndrom zugrunde liegen, haben wir erfolgreich ein patientenspezifisches, induzertes pluripotentes Stammzellmodell etabliert. Hierfür wurden Fibroblasten der Patientin, die eine Mutation im Exon 12 (c.958G>C, p.Ala320Pro) des ST3GAL3-Gens trägt, und einer gesunden Schwester mittels eines lentiviralen Vektorsystems reprogrammiert. Da ST3GAL3 die höchsten Expressionswerte im frontalen Kortex zeigte, und dies auch in Übereinstimmung mit dem vorgeschlagenen Ursprung epileptischer Anfälle steht, wurde ein Differenzierungsprotokoll für kortikale Neuronen etabliert und erfolgreich für beide Zelllinien durch geführt. Einer der größten Vorteile dieses Protokolls ist, dass hier die Neurogenese in vitro nach demselben temporalen Muster abläuft wie die Neurogenese in vivo. Die iPSC und die daraus differenzierten Neuronen wurden anschließend mittels Lectinblot, mRNA-Sequenzierung, Adhärenzassays und FACS untersucht. Während keine Unterschiede zwischen den iPSC und den Fibroblasten festgestellt wurden, konnten für die kortikalen Neuronen der Patientin eine zusätzliche Bande im Lektinblot (70 kDa), ein verändertes Adhärenzverhalten auf poly-L-Orinithin/Laminin-beschichteter Oberfläche und eine deutlich reduzierte Menge T-box-transcription factor-brain-1-exprimierende Neuronen festgestellt werden. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die ST3GAL3-Aktivität wichtig für die normale Entwicklung und Funktion des Gehirns ist.
  • Intellectual disability (ID) is a cognitive impairment disorder characterized by an intelligence quotient (IQ) below 70 and is one of the most common forms of cognitive handicaps resulting from genetic aberrations [1]. Hereditary forms of ID are genetically heterogeneous but a considerable number involve genes participating in the build-up and maintenance of the glycocalyx [2]. The glycocalyx is composed of carbohydrates that are part of the cell surface exposed lipids and proteins (including proteoglycans) or part of the extracellular matrix. We recently demonstrated that mutations in ST3GAL3 (NM_006279.2), which encodes the Golgi enzyme β-galactoside-α2,3-sialyltransferase-III, lead to varying clinical manifestations. Two independent mutations (p.Ala13Asp and p.Asp370Tyr) identified in Iranian pedigrees were associated with mild forms of non-syndromic autosomal recessive intellectual disability (NSARID)[3]. However, a third point mutation (p.Ala320Pro) identified in a Palestinian family caused West Syndrome (WS), an age-dependent epileptic encephalopathic syndrome associated with developmental arrest or, as in the case of our patients [3], regression[4]. In humans ST3GAL3 forms, among others, the sialyl Lewis a (sLea) epitope on proteins. Ectopic expression of full-length-c-MYC fusion proteins with the respective mutations in LMTK- cells showed severe functional impairment and subcellular mislocalization of all mutant gene products [5]. To further elucidate the molecular and cellular mechanisms causing West Syndrome due to the lack of ST3GAL3 function, we successfully generated induced pluripotent stem cell lines from fibroblasts obtained from a patient with West Syndrome, carrying a mutation in exon 12 (c.958G>C, p.Ala320Pro) of ST3GAL3, and a healthy sibling using lentiviral reprogramming. Since ST3GAL3 showed highest expression in the frontal cortex, which is also in accordance with the source of epileptic seizures, a differentiation protocol to cortical neurons was established and successfully accomplished for both cell lines. One of its advantages is mimicking the in vivo neurogenesis in vitro, enabling us to investigate temporal processes. IPSCs and cortical neurons derived thereof were analysed by lectin blots, mRNA sequencing, adherence assays, and FACS. While no significant difference was observed at stem cell or fibroblast level between patient and control cells, patient-derived cortical neurons displayed an additional band (70 kDa) in the lectin blot staining, enhanced adherence to a poly-L-ornithine/laminin coated surface and decreased levels of neurons expressing T-box transcription factor brain 1 (2.28 fold). Thus, our results indicate that ST3GAL3 function is important for the normal development and functioning of the brain.

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Metadaten
Author: Laura-Kristina van Diepen
URN:urn:nbn:de:gbv:9-opus-21831
Title Additional (English):Investigations into the molecular causes of hereditary disorders affecting the central nervous system
Referee:Prof. Dr. rer. nat. Andreas W. Kuss, Prof. Dr. rer. nat. Herbert Hildebrandt
Advisor:Prof. Dr. rer. nat. Andreas W. Kuss
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Year of Completion:2017
Date of first Publication:2018/05/30
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2017/11/24
Release Date:2018/05/30
Tag:neural induction
GND Keyword:Epilepsie, Stammzelle, erblich bedingte Krankheit
Pagenumber:203
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Interfakultäres Institut für Genetik und Funktionelle Genomforschung
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie