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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002386-7

Untersuchungen zum Reassortment von aviären und humanen Influenza-A-Viren des Subtyps H3 unter Verwendung der Reversen Genetik

  • Die Segmentierung des Influenza-A-Virusgenoms und die damit verbundene Möglichkeit des Reassortments sind von großer Bedeutung für die Adaptation an einen neuen Wirt und die Entstehung von Pandemien. So wurden verschiedene Influenza-Pandemien des letzten Jahrhunderts durch ein humanes Virus ausgelöst, das mindestens das Hämagglutinin (HA) eines aviären Influenza-A-Virus übernommen hatte. Mit Hilfe der Reversen Genetik ist es möglich, den Austausch von Segmenten zwischen verschiedenen Influenza-Viren detailliert zu untersuchen. Es können Erkenntnisse zur Art und Häufigkeit von Reassortments gewonnen werden, die zu einem besseren Verständnis der Entstehung potentiell pandemischer Viren führen. In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst die revers-genetische Methode der target-primed plasmid amplification erfolgreich zur Generierung des vollständigen Plasmidsatzes des c-DNA-Genoms des humanen Influenza-A-Virus A/Denver/57 (H1N1) angewendet. Die Funktionsfähigkeit des klonierten Plasmidsatzes konnte durch Kotransfektionsexperimente gezeigt werden. In einem nächsten Schritt wurde eine PCR etabliert, welche die simultane Amplifikation der cDNA der NS-, M-, NA- und NP-Segmente eines beliebigen Influenza-A-Virus ermöglicht und damit die zeitaufwendige Klonierung der Influenza-Gene deutlich beschleunigt. Dafür wurde ein Primerpaar entwickelt, das an die konservierten Termini der Gensegmente bindet, aber am 3-Ende um die Gen-spezifischen Nukleotide verkürzt ist. Mit den entwickelten Primern kann außerdem das komplette Neuraminidase-Gen unabhängig vom Subtyp amplifiziert werden. In einer Reassortmentstudie konnte die etablierte PCR zur effektiven Genotypisierung eingesetzt werden. Gegenstand der Reassortmentstudie war die Frage, ob sich ältere und jüngere aviäre Stämme in ihrer Fähigkeit, ihr HA an einen humanen Stamm abzugeben, unterscheiden. Außerdem sollte untersucht werden, welche Segmente mit dem aviären HA kosegregieren. Dafür wurden Doppelinfektionsversuche mit jeweils einem der beiden aviären Influenza-Viren A/Duck/Ukraine/1/63 (H3N8) (DkUkr63) bzw. A/Mallard/Germany/Wv64-67/05 (H3N2) (MallGer05) und dem humanen Influenza-Virus A/Hongkong/1/68 (H3N2) (Hk68) durchgeführt. Das Einführen einer Elastase-abhängigen HA-Schnittstelle in das humane Virus Hk68 ermöglichte eine effektive Selektion von Reassortanten mit aviärem HA. Unter den jeweils 21 untersuchten Plaqueisolaten gab es 16 (DkUkr63) bzw. 18 (MallGer05) Reassortanten, die mindestens das aviäre HA erworben hatten. Geringe Häufigkeiten des Auftretens bestimmter Reassortanten lieferte Hinweise bezüglich Beschränkungen im Reassortment. Bei der Genotypisierung der Plaqueisolate wurden für DkUkr63 sieben und für MallGer05 vierzehn verschiedene Reassortantenspezies gefunden. Dies deutet darauf hin, dass der Austausch der Segmente von DkUkr63 gegenüber denen von MallGer05 stärker eingeschränkt ist. Bemerkenswert war die häufige Kosegregation des NA mit HA beider Vogelviren. Die Wachstumskinetik auf humanen A549-Zellen zeigte darüber hinaus auch eine gute Replikation für alle HA/NA-Reassortanten. Beide Viren geben also ihr HA wie auch ihr NA leicht an einen humanen Stamm ab. Andererseits war die geringe Häufigkeiten von PB2- im Vergleich zu PB1-Reassortanten auffällig. Dies deutet darauf hin, dass der Austausch des PB2-Segments im Vergleich zu PB1 stärker eingeschränkt ist. Eine der am besten replizierenden Reassortanten wies mit PB1, HA und NA von DkUkr63 die gleiche Genkonstellation auf wie das Pandemievirus der Asiatischen Grippe von 1957. Die Auswertung der Plaque-Morphologie ergab, dass die Plaque-Größe der Reassortanten von der Herkunft des NA abhängig ist. Verglichen mit dem eingeschränkten Wachstum des aviären Elternvirus DkUkr63 zeigten die meisten seiner Reassortanten ein besseres Wachstum auf humanen A549-Zellen. Das jüngere aviäre Elternvirus MallGer05 erreicht fast den Endtiter des humanen Hk68 und auch die meisten Reassortanten zeigten mit Hk68 vergleichbare Endtiter. Es wurden aber für beide Vogelviren auch einige Reassortanten gefunden, deren Replikation deutlich vermindert war, was auf eine geringe Kompatibilität der jeweiligen Segmente hindeutet. Sowohl für den älteren als auch für den jüngeren aviären Elternstamm wurden unter den gewählten Selektionsbedingungen verschiedene HA-Reassortanten mit guter Replikationsfähigkeit gefunden. Dementsprechend könnten auch unter natürlichen Bedingungen sogar niedrig pathogene aviäre Influenza-A-Viren mit geringer Adaptation an einen humanen Wirt bei Koinfektionen mit humanen Viren zur Bildung von neuen, potentiell pandemischen Viren beitragen.
  • The segmentation of the influenza A virus genome enables reassortment and therefore plays an important role in adaption to new hosts and in the emergence of new pandemics. Several influenza pandemics of the past century were caused by a human virus which had incorporated a hemagglutinin (HA) from an avian virus. Reverse genetics allows for detailed analyses on the exchange of segments between different influenza strains. It is possible to gain information about type and frequency of reassortments. These insights contribute to the understanding of the emergence of new, potentially pandemic viruses. In this study, the reverse-genetics method of target-primed plasmid amplification was successfully applied to generate the complete plasmid set of cDNA of the genome of the human influenza A virus A/Denver/57 (H1N1). The functionality of the plasmid set was confirmed by cotransfection experiments. In the next step, a PCR was established which allows for the simultaneous synthesis of the NS, M, NA, and NP segments of an influenza A virus irrespective prior knowledge of their sequence. This method speeds up the time-consuming cloning influenza A viruses considerably. For this purpose, a truncated primer pair was developed that binds to the highly conserved gene termini, but lacks the gene-specific nucleotides at the 3 end. Additionally, using this primer pair, full length amplicons from the NA genes of all nine subtypes can be generated. The established PCR was used for rapid genotyping in a reassortment study. The reassortment study addressed the question whether older and younger avian strains differ in their ability to donate their HA to a human strain, and which gene segments co-segregate with the avian HA. Co-infections were performed with each of the two avian influenza viruses A/Duck/Ukraine/1/63 (H3N8) (DkUkr63) and A/Mallard/Germany/Wv64-67/05 (H3N2) (MallGer05), and the human influenza virus A/Hongkong/1/68 (H3N2) (Hk68). The introduction of an elastase-dependent cleavage site into the HA of the human Hk68 virus allowed for an effective selection of reassortants with avian virus HA. Among the 21 tested plaque isolates 16 (DkUkr63) and 18 (MallGer05) reassortants, respectively, carried at least the avian HA. Low frequencies of the appearance of different reassortants can be related to restrictions in reassortment. Genotyping of the plaque isolates showed 7 different reassortant species for DkUkr63 and 14 for MallGer05, respectively. These results indicate that the exchange of segments of DkUkr63 is constrained more strongly than it is the case for MallGer05. The frequent co-segregation of NA with the HA of both avian viruses is remarkable. Furthermore, the growth curves on human A549 cells showed a good replication for all HA/NA reassortants. Both viruses donate their HA and their NA easily to a human strain. On the other hand, the frequency of PB2 reassortants was lower than the frequency of PB1 reassortants. This indicates that the exchange of the PB2 is more strongly restricted than that of the PB1. One of the best replicating reassortants, containing the PB1, HA, and NA segments of DkUkr63 exhibited a gene constellation similar to that of the 1957 Asian flu pandamic strain. The analysis of the plaque morphology revealed that the plaque size of the reassortants depends on the origin of the NA. In comparison to the restricted growth of the avian parent virus DkUkr63 most of its reassortants showed better growth on human A549 cells. The more recent avian parent virus MallGer05 almost achieved the same end titer as the human Hk68 and most of its reassortants also showed end titers comparable to that of Hk86. However, some reassortants of both avian viruses showed clearly reduced replication, which indicates low compatibility of the respective segments. For both the historic and the contemporary avian influenza parent strains, several HA reassortants with good replication capabilities could be obtained under the chosen enforced selection conditions. In conclusion, in case of a co-infection with a human virus, even low-pathogenic influenza A viruses with poor adaption to a human host may give rise to new, potentially pandemic viruses.

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Metadaten
Author: Anne Kreibich
URN:urn:nbn:de:gbv:9-002386-7
Title Additional (English):Investigations of the reassortment of avian and human influenza A viruses with subtype H3 using reverse genetics
Advisor:Prof. Dr. Dr. h.c. Thomas C. Mettenleiter
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2015/12/18
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2015/07/01
Release Date:2015/12/18
Tag:H3N2, H3N8, Reassortment, Reverse Genetik
influenza virus, pandemic, reassortment, reverse genetics
GND Keyword:Influenzaviren, Pandemie
Faculties:Universitätsmedizin / Friedrich-Loeffler-Institut für Medizinische Mikrobiologie
DDC class:600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften / 610 Medizin und Gesundheit