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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-001256-5

Genetische Analyse und metabolische Deregulation der Coenzym A-Biosynthese in der Hefe Saccharomyces cerevisiae

  • Coenzym A ist ein essentieller und ubiquitärer Cofaktor, dessen zentrale Bedeutung für den Stoffwechsel aus der Aktivierung und Übertragung von Acylgruppen resultiert. Der Biosyn-theseweg von Coenzym A (CoA) ausgehend von Pantothenat (Pan) umfasst fünf enzymatische Schritte, die in Pro- und Eukaryoten konserviert sind. Die Hefe S. cere¬visiae ist in der Lage, sowohl eine de novo Pantothenat-Synthese durchzuführen als auch mittels Fen2-Transporter dieses Intermediat aufzunehmen. Die Phosphorylierung von Pan durch die Pantothenat Kinase (PanK) stellt vermutlich den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt dar, der in Form einer Inhibition durch das Endprodukt bzw. dessen Derivate erfolgt. Ziel dieser Arbeit sollte es sein, grundlegende Erkenntnisse zu den Enzymen des CoA-Biosyntheseweges, deren Organisation und Regulation in der Hefe zu bekommen. Durch „metabolic engineering“ sollte versucht werden, einen Stamm zu konstruieren, der im Vergleich zu einem Wildtyp einen erhöhten CoA-Gehalt aufweist. Für das Genprodukt von YDR531W in S. cerevisiae konnte aufgrund der Verwertbarkeit von 14C-Pantothenat als Substrat die Vermutung bestätigt werden, dass es sich um eine PanK handelt, so dass dieses Gen die neue Bezeichnung CAB1 („Coenzym A Biosynthese“) erhielt. Es erfolgt eine „Feedback“-Inhibition durch CoA und in stärkerem Maße durch dessen Thioester Acetyl-CoA. Der Einfluss von Malonyl-CoA und Palmitoyl-CoA auf die Aktivität der PanK ist vernachlässigbar. Durch gerichtete Mutagenese konnte eine Acetyl-CoA insensitive deregulierte PanK-Variante CAB1W331R erzeugt werden, die, verglichen mit dem Wildtyp, eine etwa vierfach gesteigerte Aktivität aufweist. Für die vier weiteren Gene YIL083C, YKL088W, YGR277C und YDR196C, die aufgrund von Ähnlichkeiten zu humanen CoA-Genen identifiziert wurden, konnte der Nachweis erbracht werden, dass es sich um CoA-Biosynthesegene handelt. Eine Nullmutation in jedem dieser essentiellen Gene ließ sich durch das entsprechende E. coli Gen, für die der enzymatische Nachweis der Genprodukte vorliegt, heterolog komplementieren. Folgende neue Genbe-zeichnungen wurden aufgrund der Abfolge der Reaktionsschritte vergeben: YIL083C = CAB2 (codiert für die Phosphopantothenyl Cystein Synthetase, PPCS), YKL088W = CAB3 (Phosphopantothenylcystein Decarboxylase, PPCDC), YGR277C = CAB4 (Phosphopante-thein Adenyltransferase, PPAT) und YDR196C = CAB5 (Dephospho-CoA.Kinase, DPCK). Für CAB1, CAB2 und CAB5 war ein moderater Anstieg der Genexpression zu beobachten, wenn Glucose durch Ethanol als C-Quelle ersetzt wurde. Die Abwesenheit von Aminosäuren beeinflusste die Expression der CAB Gene kaum. Mit Hilfe chromatographischer Reinigungsschritte war eine Cofraktionierung der epitopmar-kierten Proteine Cab3 und Cab5 möglich, die einen ersten Hinweis auf die Existenz eines CoA-synthetisierenden Enzymkomplexes (CoA-SPC) lieferten. Dessen durch Gelfiltration bestimmte Größe beträgt ungefähr 327 kDa. In vitro-Interaktionsstudien ergaben, dass Cab1 (PanK) nicht an der Bildung dieses Komplexes beteiligt ist und dass Cab2, Cab3, Cab4 und Cab5 mit Cab3 interagieren. Weiterhin konnten Wechselwirkungen zwischen Cab4 und Cab5 nachgewiesen werden. Durch Konstruktion von Längenvarianten der genannten Proteine wurden die für die Interaktionen jeweils verantwortlichen Proteinabschnitte kartiert. Vermutlich dient Cab3 als zentrales „Gerüstprotein“ des gesamten CoA-SPC-Komplexes. Mit ausschließlich bakteriell synthetisierten Proteinen konnte zumindest für Cab3 gezeigt werden, dass die Interaktionen direkt erfolgen. In einem weiteren Teil dieser Arbeit wurde versucht, durch Überexpression der CoA-Bio-synthesegene die zelluläre CoA-Synthese zu beeinflussen. Mit Hilfe integrativer Plasmide wurden MET25-Promotor-kontrollierte Überexpressionskassetten aller CAB-Gene sukzes¬sive in einen Wildtypstamm eingeführt. Für das Gen der PanK wurde das Wildtyp-Allel CAB1 bzw. die deregulierte Variante CAB1W331R verwendet. Einen Unterschied zwischen den Stämmen konnte für den Acetyl-CoA-, allerdings nicht für den CoA-Gehalt gemessen werden. Überexpressionsstämme mit der regulierten PanK bzw. der deregulierten PanK-Variante enthielten im Vergleich zum Wildtyp die 3-fache bzw. sogar die 6-fache Menge an Acetyl-CoA. Dieser Befund belegt die Schrittmacherfunktion der PanK für den gesamten CoA-Biosyntheseweg.
  • Coenzyme A (CoA) is an essential cofactor that exists ubiquitously and plays a central role in transfer and activation of acyl groups. Biosynthesis of CoA starts from pantothenic acid and requires five enzymatic steps which are conserved in eukaryotes and prokaryotes. The yeast Saccharomyces cerevisiae is able to synthesize pantothenic acid de novo from several amino acids but it can be taken up also from the outside by the plasmamembrane transporter Fen2. Phosphorylation of pantothenic acid by pantothenate kinase (PanK) probably represents the rate-limiting step of the entire pathway because of its inhibition by CoA or CoA thioesters. The goal of this work was to obtain fundamental insights about the enzymes of the CoA biosynthetic pathway, their organization and their regulation in yeast. Using "metabolic engineering", a strain with an increased content of CoA, compared to a wild-type, should be constructed. The functional complementation of a yeast ydr531w mutation by mammalian and bacterial PanK genes and enzyme assays with radiolabeled pantothenate confirmed that this gene encodes a genuine pantothenate kinase. Thus, this gene was re-named CAB1 (“coenzyme A biosynthesis). Yeast PanK is inhibited by the thioester acetyl-CoA and to a lesser extent by CoA. The influence of the CoA derivates malonyl-CoA and palmitoyl-CoA on PanK activity is negligible. Modification of the CAB1 sequence by site-directed mutagenesis resulted in a catalytic active PanK variant (CAB1W331R) which was no longer regulated by CoA or its thioesters but showed a four times increased PanK activity, compared to the wild-type. It could be shown that the four genes YIL083C, YKL088W, YGR277C and YDR196C initially identified by similarity to human CoA biosynthetic genes are encoding the four remaining enzymes involved in yeast CoA biosynthesis. Null mutants of these essential genes were complemented by the corresponding bacterial genes for which the enzymatic verification of gene products had been done in E. coli. The following new gene designations were created, based on the sequence of reaction steps: YIL083C = CAB2 (encoding phosphopantothenoyl-cysteine synthetase, PPCS), YKL088W = CAB3 (phosphopantothenoylcysteine decarboxy-lase, PPCDC), YGR277C = CAB4 (phosphopante¬theine adenyltransferase, PPAT) and YDR196C = CAB5 (dephospho-CoA kinase, DPCK). Gene expression studies showed a slight increase of reporter gene expression for CAB1, CAB2 and CAB5 when transformants were cultivated in the presence of the non-fermentable carbon source ethanol, compared with glucose as a carbon source. The absence of amino acids did not significantly alter gene expression. The first evidence for the existence of a CoA-synthesizing protein complex (CoA-SPC) was provided by the results of gel filtration studies. Epitope-labeled proteins Cab3 and Cab5 cofractionated with a protein complex of 327 kDa. In vitro interaction experiments revealed that Cab1 (PanK) is not involved in the formation of this complex and that Cab2, Cab3, Cab4 and Cab5 interact with Cab3. By construction of length variants of these proteins, minimal segments responsible for interactions with Cab3 were mapped. Presumably, Cab3 is the “scaffolding protein” of CoA-SPC. Interaction experiments with proteins completely synthe-sized in bacteria confirmed that the interaction of Cab proteins with Cab3 occurs directly. In a final part of this work it was attempted to influence cellular CoA biosynthesis by overexpression of the CoA biosynthetic genes. Using integrating plasmids, a strain was obtained which carried overexpression constructs of the five CoA biosynthetic genes controlled by the MET25 promoter. Two variants of CAB1 (wild-type allele CAB1 and the deregulated CAB1W331R allele) were used. While the CoA content of transformants remained almost constant, the amount of acetyl-CoA was increased 3-fold (with CAB1) and even 6-fold (with CAB1W331R), compared to the wild-type. These findings demonstrate that PanK is a major rate-limiting step of the entire CoA biosynthetic pathway.

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Metadaten
Author: Judith Olzhausen
URN:urn:nbn:de:gbv:9-001256-5
Title Additional (English):Genetic analysis and metabolic engineering of the coenzyme A-biosynthesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae
Advisor:Prof. Dr. Hans-Joachim Schüller
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2012/06/07
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2012/05/29
Release Date:2012/06/07
Tag:Metabolische Deregulation, Pantothenat Kinase
GND Keyword:Coenzym A, Genetik, Saccharomyces cerevisiae
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Mikrobiologie - Abteilung für Genetik & Biochemie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie