Open Access

Ina S. L. Buchholz

• The soluble blood protein beta2-glycoprotein I (beta2GPI; 326 aa, MW: 48 kDa, 5 domains) is one of the most abundant proteins in human serum and exhibits two main conformational states: the circular or closed conformation, where the first domain (DI) is bound to the last domain (DV) of the protein, and the linear or open conformation. The defined physiological function of beta2GPI is still unknown, though several roles in pro- and anticoagulation as well as oxidative stress protection were discovered. The open form is considered to play a crucial role in the systemic autoimmune disease antiphospholipid syndrome (APS), which is an acquired thrombophilia characterized by recurring thrombotic events and pregnancy morbidity. Beta2GPI constitutes the main antigen for APS autoantibodies which are supposed to bind a cryptic epitope within DI after a conformational change from closed to open form. However, the pathophysiological mechanism of APS is poorly understood. Therefore, investigating the structural dynamics of this protein in relation to its antigenicity is of high interest. Post-translational modifications (PTM) of a target protein often show an impact on the formation of neoantigens, for instance in the autoimmune-mediated diseases type 1 diabetes mellitus, rheumatoid arthritis, or multiple sclerosis. Such modified antigens may lead to immune tolerance breakdown as they are unknown to the immune system, which therefore could mistakes self for non-self proteins. In this thesis, two frequently occurring PTM were introduced to beta2GPI and their impact on the protein conformation was studied by biophysical tools (i.e. atomic force microscopy (AFM) imaging, transmission electron microscopy (TEM) imaging, dynamic light scattering (DLS), and circular dichroism (CD) spectroscopy). In order to examine immunopathophysiological relevance of these PTM, additional insights were gained from ELISA which was used to examine binding of anti-DI autoantibodies purified from the blood of APS patients to the modified beta2GPI species. A characteristic feature of beta2GPI is the high content of lysine residues. Previously, opening of beta2GPI was found to be triggered by a drastic shift in pH and salt concentration (pH 11.5 and 1.15 M NaCl), which results in reversible uncharging of the lysine residues. The aim of this study was to investigate the beta2GPI conformation after lysine acetylation as a model system, to elucidate the role of lysine residues on the conformational dynamics of this protein, and to examine anti-DI autoantibody binding to both the untreated as well as acetylated species. A strategy to permanently open up the closed form under physiological conditions by chemical acetylation of lysine residues utilizing the sensitive acetylation agent acetic acid N-hydroxysuccinimide ester (NHS-Ac) was established. Complete and specific lysine acetylation was verified by quantification of primary amines exerting a fluoraldehyde o-phthaldialdehyde (OPA) reagent assay, as well as by native PAGE and western blot analysis with an anti-acetylated lysine antibody. Beta2GPI acetylation revealed a partial opening of beta2GPI molecules. Compared to untreated, i.e. native beta2GPI which exhibited 93% of the molecules in closed and 7% in open form, complete lysine residue acetylation generated 39% of beta2GPI in closed and 61% in open conformation as shown by AFM high-resolution imaging. pH 11.5-treated beta2GPI was used as a reference in the applied methods and revealed 38% of the protein in closed and 62% in open conformation. Thus, a significant shift in beta2GPI conformation occurred upon lysine residue acetylation as well as basic pH-treatment. The data indicate that lysine residue acetylation destabilizes the closed form, leading to a facilitated opening of the structure. The closed conformation might be predominantly stabilized by electrostatic interactions of lysine residues, which potentially control the conformational dynamics of this glycoprotein. ELISA confirmed that anti-DI autoantibodies do not bind to untreated (closed) beta2GPI. Although acetylated beta2GPI was shown to have a substantial portion of open proteins, no binding of anti-DI autoantibodies to the acetylated species was found either. Hence, acetylated lysine residues may disrupt the immunorelevant epitope in DI which prevents antibody binding. This finding reveals a new hint for epitope organization. However, further detailed epitope mapping has to be performed. Beta2GPI carries two structural disulfide bonds per domain, whereas an additional disulfide bond Cys288/Cys326 is located at the C-terminus of DV near the putative contact interface of DI and DV in the closed conformation. It was previously shown that beta2GPI is a substrate of thiol oxidoreductases, including human thioredoxin-1 (Trx-1) generating different redox states of disulfide bond Cys288/Cys326, which might serve as a scavenger in oxidative stress protection in the blood stream. In APS patients, anti-DI antibody titers as well as an enhanced risk for thrombotic events are associated with an increase in the oxidized state of the protein. Hitherto, no structural study has been performed in order to prove a correlation of the redox state and the conformation of beta2GPI. Therefore, investigations of beta2GPI conformation in different redox states of disulfide bond Cys288/Cys326 were carried out. In addition, binding of anti-DI autoantibodies to the untreated (native) as well as reduced protein should be explored. At first, cysteine residues of untreated, i.e. native beta2GPI were confirmed to be completely in oxidized state using Ellman’s reagent assay and the absence of binding of a thiol-specific agent. Statistical analyses of AFM images revealed that untreated beta2GPI was mainly in closed conformation (80% in closed and 20% in open conformation) in the respective system. In this study, an optimized protocol for enzymatic reduction of disulfide bond Cys288/Cys326 was established. The agent TCEP was used to reduce human Trx-1, which in turn enzymatically reduced beta2GPI. To block reoxidation of free thiols and to facilitate product analysis, cysteine residues of reduced beta2GPI were subsequently labeled with the sensitive and thiol-specific reagent 3-(N-maleimidopropionyl) biocytin (MPB), which carries a biotin function. During protocol establishment, complete and specific reduction of disulfide bond Cys288/Cys326 was confirmed utilizing SDS-PAGE, streptavidin western blot, mass spectrometry (MS) analyses, and a biotin quantification assay. Protocol improvements constituted a homogenous system with remarkable decrease of unspecifically reduced beta2GPI. Upon beta2GPI reduction, AFM imaging revealed no significant shift in protein conformation (75% in closed and 25% in open conformation). These results were qualitatively confirmed by TEM imaging. Therefore, reduction of beta2GPI disulfide bond Cys288/Cys326 did not result in a major conformational change of the protein. Upon in vitro reduction, the closed form is still the main conformation and a direct correlation of beta2GPI redox state and conformation must be refused. Furthermore, beta2GPI reduction led to a strong and statistically highly significant increase in anti-DI autoantibody binding compared to untreated beta2GPI. Thus, the reduced form might be the antigenic form of the protein. In contrast to previous knowledge, these findings suggest that anti-DI autoantibodies may also bind to the closed conformation under certain conditions. Hypothetically, reduction of beta2GPI could induce a minor structural change in DV that might facilitate the binding of APS autoantibodies. Overall, this study reveals that PTM of beta2GPI may lead to a critical level of destabilization of the closed conformation (as in the case of acetylated beta2GPI) or significantly increase the binding of APS autoantibodies (as in the case of reduced beta2GPI), both of which could have a large impact on APS disease. However, further investigations are necessary to put these new findings in the context of APS immunopathophysiology.
• Das lösliche Blutprotein beta2-Glykoprotein I (beta2GPI; 326 Aminosäuren, MW: 48 kDa, 5 Domänen) ist eines der am häufigsten im menschlichen Serum vorkommende Protein und weist zwei Hauptkonformationszustände auf: Die zirkuläre oder geschlossene Konformation, bei welcher die erste Domäne (DI) an die letzte Domäne (DV) des Proteins gebunden ist, und die lineare oder offene Konformation. Die genaue physiologische Funktion des beta2GPI ist noch unbekannt, obgleich bereits verschiedene Aufgaben in der Pro- und Antikoagulation sowie beim Schutz vor oxidativem Stress entdeckt wurden. Der offenen Form wird eine entscheidende Rolle in der systemischen Autoimmunerkrankung Antiphospholipid-Syndrom (APS) zugeschrieben, einer erworbenen Thrombophilie, welche durch wiederkehrende Thrombosen und Schwangerschaftsmorbidität gekennzeichnet ist. Beta2GPI stellt das zentrale Antigen für APS-Autoantikörper dar, welche vermutlich nach einem Konformationswechsel von der geschlossenen zur offenen Form an ein kryptisches Epitop innerhalb der DI binden. Der pathophysiologische Mechanismus des APS ist jedoch nur unzureichend verstanden, sodass Untersuchungen der strukturellen Dynamik des beta2GPI in Verbindung mit seiner Antigenität von hohem Interesse sind. Post-translationale Modifikationen (PTM) eines Zielproteins haben oft großen Einfluss auf die Bildung von Neoantigenen, wie zum Beispiel bei den autoimmunvermittelten Erkrankungen Diabetes mellitus Typ 1, Rheumatoide Arthritis oder Multiple Sklerose. Modifizierte Antigene können zu einem Zusammenbruch der Immuntoleranz führen, da sie dem Immunsystem unbekannt sind und dieses daher fälschlicherweise körpereigene für körperfremde Proteine halten kann. In dieser Arbeit wurde beta2GPI mit zwei der am häufigsten vorkommenden PTM modifiziert und deren Einfluss auf die Proteinkonformation mit biophysikalischen Methoden untersucht (Rasterkraftmikroskopie (AFM), Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), dynamische Lichtstreuung (DLS) und Zirkulardichroismus (CD) Spektroskopie). Um die immunpathophysiologische Relevanz dieser PTM zu untersuchen, wurden zusätzliche Erkenntnisse aus einem ELISA gewonnen, mit dem die Bindung von aus dem Blut von APS-Patienten gereinigten anti-DI-Autoantikörpern an die modifizierten beta2GPI-Spezies getestet wurde. Ein charakteristisches Merkmal von beta2GPI ist ein hoher Anteil der Aminosäure Lysin. Zuvor wurde festgestellt, dass eine Öffnung der beta2GPI-Konformation durch eine drastische Verschiebung des pH-Wertes und der Salzkonzentration (pH 11,5 und 1,15 M NaCl) ausgelöst wird, was zu einer reversiblen Neutralisierung der unter physiologischen Bedingungen positiv geladenen Lysinseitenketten führt. Ziel dieser Studie war es, die beta2GPI-Konformation nach Acetylierung der Lysinreste als Modellsystem zu untersuchen, die Rolle der Lysinreste in der Konformationsdynamik dieses Proteins aufzuklären und die Bindung von anti-DI-Autoantikörpern sowohl an unmodifiziertes als auch an acetyliertes beta2GPI zu untersuchen. Es wurde eine Strategie zur dauerhaften Öffnung der geschlossenen Proteinkonformation unter physiologischen Bedingungen durch chemische Acetylierung der Lysinreste unter Verwendung des sensitiven Acetylierungsmittels Essigsäure-N-hydroxysuccinimidester (NHS-Ac) etabliert. Die spezifische und vollständige Acetylierung wurde anhand der Quantifizierung der primären Aminogruppen mit dem Fluoraldehyd-haltigen Reagenz o-Phthaldialdehyd (OPA), nativer PAGE sowie durch Western Blot-Analyse mit einem anti-acetylierten Lysin-Antikörper nachgewiesen. Nach Acetylierung des beta2GPI lag ein Großteil der Proteine in der offenen Konformation vor. Im Vergleich zu unbehandeltem, d.h. nativem beta2GPI, welches zu 93 % in geschlossener und 7 % in offener Form abgebildet wurde, erzeugte die vollständige Lysinacetylierung 39 % beta2GPI in geschlossener und 61 % in offener Konformation, wie anhand von hochauflösenden AFM-Bildern gezeigt wurde. pH 11,5-behandeltes beta2GPI wurde als Referenz in den angewandten Methoden gebraucht und ergab 38 % des Proteins in geschlossener und 62 % in offener Konformation. Somit kam es sowohl bei der Acetylierung der Lysinreste als auch unter Behandlung mit einem basischen pH zu einer signifikanten Veränderung der beta2GPI-Konformation. Die Daten deuten darauf hin, dass die Acetylierung der Lysinreste die geschlossene Form destabilisiert, was zu einer erleichterten Öffnung der Struktur führt. Somit könnte die geschlossene Konformation vorwiegend durch elektrostatische Wechselwirkungen der Lysinreste stabilisiert sein, welche die Konformationsdynamik dieses Glykoproteins steuern. Anhand eines ELISA wurde bestätigt, dass anti-DIAutoantikörper nicht an unbehandeltes (geschlossenes) beta2GPI binden. Obwohl in dieser Studie gezeigt wurde, dass Lysin-acetyliertes beta2GPI einen beträchtlichen Anteil an offenen Proteinen aufweist, wurde auch an die acetylierte Species keine Bindung der anti-DI-Autoantikörper beobachtet. Möglicherweise unterbricht die Acetylierung der Lysinreste das immunorelevante Epitop in DI, sodass eine Antikörperbindung trotz offener Konformation verhindert wird. Diese Erkenntnisse liefern einen neuen Hinweis auf die Epitoporganisation, wobei jedoch eine weitere detaillierte Epitopkartierung durchgeführt werden muss. Beta2GPI besitzt in jeder seiner fünf Domänen zwei strukturelle Disulfidbindungen, wobei sich am C-Terminus von DV eine zusätzliche Disulfidbindung Cys288/Cys326 in der Nähe der putativen Kontaktstelle von DI und DV in der geschlossenen Konformation befindet. Zuvor konnte gezeigt werden, dass beta2GPI ein Substrat von Thiol-Oxidoreduktasen, wie dem humanen Thioredoxin-1 (Trx-1), darstellt. Somit werden verschiedene Redox-Zustände der Disulfidbindung Cys288/Cys326 erzeugt, was vermutlich dem Schutz vor oxidativem Stress im Blutstrom dient. Bei APS-Patienten stehen anti-DI-Antikörpertiter sowie ein verstärktes Risiko für thrombotische Ereignisse in Zusammenhang mit einer erhöhten Konzentration des oxidierten Proteins. Bisher wurde jedoch keine Proteinstrukturstudie durchgeführt, um eine Korrelation zwischen dem Redox-Zustand und der Konformation des beta2GPI nachzuweisen. Somit wurden in dieser Studie die verschiedenen Redox-Zuständen der Disulfidbindung Cys288/Cys326 im Hinblick auf die Konformation des beta2GPI untersucht. Darüber hinaus wurde die Bindung von anti-DI-Autoantikörper an das unmodifizierte (native) sowie das reduzierte Protein geprüft. Zunächst konnte in dieser Studie unter Verwendung des Ellman’schen Reagenzienassays und durch die fehlende Bindung eines thiolspezifischen Liganden bestätigt werden, dass die Cysteinreste des unbehandelten, d.h. nativen beta2GPI vollständig im oxidierten Zustand vorliegen. Statistische Analysen von AFM-Bildern zeigten, dass unbehandeltes beta2GPI auch in diesem System hauptsächlich in geschlossener Konformation (80 % in geschlossener und 20 % in offener Konformation) vorlag. Es wurde ein optimiertes Protokoll für die enzymatische Reduktion der Disulfidbindung Cys288/Cys326 etabliert. TCEP wurde zur Reduktion von humanem Trx-1 verwendet, welches wiederum beta2GPI enzymatisch reduzierte. Um die Reoxidation freier Thiole zu blockieren und die Produktanalyse zu erleichtern, wurden die Cysteinreste des reduzierten beta2GPI anschließend mit dem sensitiven, thiolspezifischen und Biotin-funktionalisierten Reagenz 3-(N-Maleimidopropionyl) Biozytin (MPB) markiert. Während der Etablierung des Protokolls wurde die vollständige und spezifische Reduktion der Disulfidbindung Cys288/Cys326 anhand von SDS-PAGE, Streptavidin-Western Blot, Massenspektrometrie (MS)-Analysen und eines Biotin-Quantifizierungsassays bestätigt. Die Optimierung des Protokolls resultierte in einem homogenen System mit einer deutlichen Verringerung an unspezifisch reduziertem beta2GPI. Nach der Reduktion des Proteins zeigte die AFM-Bildgebung keine signifikante Veränderung der Proteinkonformation (75 % in geschlossener und 25 % in offener Konformation). Diese Ergebnisse wurden anhand von TEM-Bildern qualitativ bestätigt. Somit führte die Reduktion der Disulfidbindung Cys288/Cys326 des beta2GPI nicht zu einer wesentlichen Konformationsänderung des Proteins. Nach in vitro-Reduktion ist die geschlossene Form immer noch die hauptsächlich vorliegende Konformation, sodass keine direkte Korrelation des Redoxzustands und der Konformation von beta2GPI besteht. Darüber hinaus führte die Reduktion des beta2GPI zu einem starken und statistisch hochsignifikanten Anstieg der Bindung von anti-DI-Autoantikörpern im Vergleich zu unbehandeltem beta2GPI. Somit könnte die reduzierte Form die antigene Form des Proteins darstellen. Im Gegensatz zu den bisherigen Erkenntnissen deuten die Ergebnisse darauf hin, dass anti-DI-Autoantikörper unter bestimmten Bedingungen auch an die geschlossene Konformation binden können. Hypothetisch könnte eine Reduktion von beta2GPI eine geringfügige strukturelle Veränderung in DV induzieren, welche die Bindung von APS-Autoantikörpern möglicherweise erleichtert. Insgesamt zeigt diese Studie, dass PTM von beta2GPI zu einem kritischen Ausmaß der Destabilisierung der geschlossenen Konformation führen können (wie im Fall von Lysin-acetyliertem beta2GPI) oder die Bindung von APS-Autoantikörpern signifikant erhöhen (wie im Fall von reduziertem beta2GPI), was beides eine große Bedeutung für die Erkrankung APS haben könnte. Es sind jedoch weitere Untersuchungen notwendig, um diese neuen Erkenntnisse in den Kontext der Immunpathophysiologie des APS zu stellen.