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Zerebrale Kavernomatose - Identifizierung tief-intronischer Varianten in den genomischen Regionen von CCM1, CCM2 und CCM3 mittels Hochdurchsatzsequenzierung

  • Zerebrale kavernöse Malformationen (CCM) sind autosomal-dominant vererbbare zerebrovaskuläre Fehlbildungen, die mit unvollständiger Penetranz zu Kopfschmerzen, Krampfanfällen und hämorrhagischen Schlaganfällen führen können. Bisher wurden drei Gene mit CCM assoziiert: CCM1 (KRIT1), CCM2 (Malcavernin) und CCM3 (PDCD10). Trotz stringenter Einschlusskriterien bleiben etwa 40 % der nicht-familiären CCM-Fälle in der molekulargenetischen Standarddiagnostik mutations-negativ. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, mittels Hochdurchsatzsequenzierung die bisher wenig untersuchten, nicht-kodierenden Bereiche der drei Gene auf das Vorliegen putativ pathogener Varianten hin zu untersuchen. Zur Anreicherung der Zielregionen wurde hierfür ein Long-Range-PCR-Ansatz (LR-PCR) etabliert. Dessen Praktikabilität und Zuverlässigkeit wurde durch die Sequenzierung mehrerer mutations-positiver Kontrollproben bestätigt. Mit diesem Ansatz wurden 20 mutations-negative Probanden auf der MiSeq®-Plattform reanalysiert. Dabei konnten 36 bisher nicht beschriebene oder seltene Varianten in heterozygotem Zustand detektiert werden. Nach einer mehrstufigen Filterstrategie wurden 14 dieser Sequenzveränderungen als putativ pathogen priorisiert, die bei zehn Probanden auftraten. Untersuchungen zum familiären Auftreten konnten eine Kausalität der Varianten nicht untermauern. Auch Transkriptanalysen bei fünf der zehn Probanden mit priorisierten Varianten führten nicht zum Nachweis einer funktionellen Relevanz. Für die verbleibenden fünf Fälle lagen RNA-Proben nicht vor und weitere Analysen müssten sich anschließen, um eine Kausa-lität detektierter Varianten zu bewerten. Zusammenfassend konnte die Verlässlichkeit des bisher in der CCM-Analytik nicht beschriebenen Ansatzes einer Hochdurchsatzsequenzierung nach LR-PCR-Anreicherung zur Detektion von Sequenzvarianten in kodierenden und nicht-kodierenden Genbereichen von CCM1, CCM2 und CCM3 belegt werden. Sichere tief-intronische Spleißmutationen ließen sich in einer Zusammenschau der bioinformatischen Bewertungen und der durchgeführten experimentellen Untersuchungen jedoch nicht nachweisen. Der klinische Nutzen einer standardmäßigen Analyse der großen intronischen Bereiche der drei Gene scheint daher begrenzt. Für die mutationsnegativen Probanden müssen damit weitere genetische und nicht-genetische Ursachen in Erwägung gezogen werden.
  • Cerebral cavernous malformations (CCMs) are vascular malformations of the central nervous system which can lead to headaches, seizures and hemorrhagic strokes. Familial forms are inherited in an autosomal dominant manner with incomplete penetrance. So far, three genes have been associated with CCM: CCM1 (KRIT1), CCM2 (malcavernin) and CCM3 (PDCD10). Despite stringent inclusion criteria about 40% of non-familial CCM cases remain mutation-negative in standard molecular genetic diagnostics. The aim of this study was to investigate the previously unexplored, non-coding regions of the three genes by high-throughput sequencing for the presence of putative pathogenic variants. For target enrichment, a long-range PCR (LR-PCR) approach was established. Its practicability and reliability was confirmed by sequencing of several mutation-positive control samples. With this approach, 20 mutation-negative probands were re-analyzed on the MiSeq® platform. During this, 36 previously unknown or rare heterozygous variants could be detected. After a filter strategy 14 of the detected variants were prioritized as putative pathogenic. Segregation analyses could not support a causality of these variants. Also transcript analyses in five of ten probands with prioritized variants did not prove the functional relevance. For the remaining five cases, RNA samples were not available and further analyses have to follow to evaluate the causality of detected variants. In summary, the reliability of the method of high-throughput sequencing after LR-PCR enrichment, which was not previously described in CCM analysis, was demonstrated for the detection of sequence variants in coding and non-coding gene regions of CCM1, CCM2 and CCM3. However, deep-intronic splice mutations could not be demonstrated by bioinformatic evaluations and the conducted experimental investigations. The clinical utility of a standard analysis of the large intronic regions of the three genes thus appears limited. For the mutation-negative probands further genetic and non-genetic causes have to be considered.

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Metadaten
Author: Sönke Elisabeth Jenssen
URN:urn:nbn:de:gbv:9-opus-34222
Title Additional (English):Cerebral cavernomatosis - Identification of deep intronic variants in the genomic regions of CCM1, CCM2 and CCM3 by high-throughput sequencing
Referee:Prof. Dr. Ute Felbor, Prof. Dr. Christian Hübner
Advisor:Prof. Dr. Ute Felbor
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Year of Completion:2016
Date of first Publication:2019/12/16
Granting Institution:Universität Greifswald, Universitätsmedizin
Date of final exam:2019/10/22
Release Date:2019/12/16
Tag:CCM, Tief-intronische Spleißmutationen, Zerebrale Kavernomatose
Cerebral cavernous malformations
GND Keyword:Zerebrale Kavernomatose
Pagenumber:101
Faculties:Universitätsmedizin / Institut für Humangenetik
DDC class:600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften / 610 Medizin und Gesundheit