Open Access

Marleen J. Meyer

• Organic cation transporter OCT1 is strongly expressed in the sinusoidal membrane of hepatocytes. OCT1 mediates the uptake of weakly basic and cationic compounds from the blood into the liver and may thereby facilitate the first step in hepatic metabolism or excretion of many cationic drugs. OCT1 is a polyspecific transporter and has a very broad spectrum of structurally highly diverse ligands (substrates and inhibitors). The exact transport mechanism and the amino acids involved in polyspecific ligand binding of OCT1 are poorly understood. The aim of this work was to utilize the polyspecificity to better understand the structure-function relationships of OCT1 and to gain first insights into potential mechanisms conferring the polyspecificity. We followed two strategies, analyzing the effects of variability in both ligand and transporter structure on OCT1 function. The effects of ligand structure were analyzed by comparing uptake and inhibitory potencies of structurally similar drugs of the group of opioids. The effects of transporter structure were analyzed by comparing the effects of variability caused by naturally occurring genetic variants or artificial mutations on OCT1 uptake and inhibition of several substrates. Most importantly, the effects of interspecies variability in transporter structure were analyzed by comparing uptake kinetics between human and mouse OCT1 orthologs. To this end, we used stably or transiently transfected HEK293 cells overexpressing OCT1 and different chimeric and mutant variants thereof. Focusing on OCT1 ligands, we compared the uptake and inhibitory potencies of structurally similar opioids. Only minor changes of the ligand structure strongly affected the interaction with OCT1. The presence of the ether linkage between C4 and C5 of the morphinan ring was associated with reduced OCT1 inhibitory potencies, while passive membrane permeability was the major negative determinant of OCT1-mediated uptake among structurally highly similar morphinan opioids. Only minor structural changes strongly increased the inhibitory potency by 28-fold from the lowest IC50 of 2004 µM for oxycodone to 72 µM for morphine. Additional removal of the ether linkage between C4-C5 increased the inhibitory potency by a total of 313-fold to the lowest IC50 of 6 µM for dextrorphan. Consequently, our data demonstrates that despite its polyspecificity, OCT1-mediated uptake and inhibition of this uptake is still somewhat very specific. Focusing on OCT1 protein structure, we first analyzed the effects of variability caused by naturally occurring genetic variants on OCT1 uptake and inhibition. OCT1 transport was strongly affected by OCT1 genetic variants and these effects were often substrate-specific. Correlation of these effects revealed several substrates that were similarly affected by the variants and may therefore be suggested to share similar or overlapping binding sites in OCT1. In addition, the effects of the genetic variants OCT1*2 and OCT1*3 on different substrates correlated well which may suggest that the structural variability caused by these two variants similarly affects substrate uptake. OCT1 genetic variants also affected the inhibition of OCT1, with both substrate and genotype-specific differences. Ranitidine inhibited the uptake of several substrates, among them the clinically relevant drugs metformin and morphine. Moreover, the inhibition was more potent (about 2-fold) on the uptake mediated by the common genetic variant OCT1*2 than on the uptake mediated by the reference OCT1*1. Second, we analyzed the effects of artificial mutations of key amino acids. Tyr222 and Asp475 in rat OCT1 had strongly substrate-specific and also species-specific effects on both OCT1-mediated uptake and inhibition. Mutation of these amino acids strongly decreased OCT1-mediated uptake, which further underscored an important role especially of Asp475. Interestingly, despite a proposed essential role of this amino acid, we observed Asp475-independent transport. This transport was observed in mouse, but not in human OCT1 and was substrate-specific. TMH10 was identified to be involved in determining the Asp475-independent uptake of mouse OCT1. Finally and most importantly, we analyzed the effects of sequence differences between human and mouse OCT1 on the transport kinetics of several OCT1 substrates. The transport kinetics differed strongly between human and mouse OCT1 orthologs. These differences were substrate-specific and affected both the affinity (KM) and capacity (vmax) of transport. Human OCT1 had an 8-fold higher capacity of trospium transport, while mouse OCT1 had an 8-fold higher capacity of fenoterol transport. Furthermore, mouse OCT1 had a 5-fold higher affinity for metformin transport compared to human OCT1. The difference between Phe32 in human and Leu32 in mouse OCT1 in TMH1 was identified to confer a higher capacity of transport by human compared to mouse OCT1, while the difference between Cys36 in human and Tyr36 in mouse OCT1 in TMH1 was identified to confer a higher capacity of transport by mouse compared to human OCT1. Furthermore, Leu155 in human OCT1, corresponding to Val156 in mouse OCT1 in TMH2, in concert with TMH3 were identified to confer the differences in affinity for metformin transport between the species. It may be speculated that ligand binding in OCT1 involves a core binding region that includes Asp474/475 and that polyspecific ligand binding is enabled by providing further binding partners (different amino acids) in more peripheral regions that different ligands can selectively interact with. This mechanism may also be a first step in explaining the substrate-specific effects of genetic variants with clinical relevance. Based on our findings, these “polyspecificity regions” may include TMH1, TMH2, and TMH3. Further analyses are warranted to characterize and narrow down these regions to unravel the structure-function relationships and with that the polyspecificity of OCT1. To summarize, variability in both ligand and transporter structure strongly affected OCT1 function and we were able to identify ligand structures that affect inhibitory potency and protein structures that confer species-specific differences in OCT1 transport. This work emphasizes again the complexity of OCT1 transport and structure-function relationships. We also showed that, in spite of the difficulties for experimental analysis and data interpretation that arise from the polyspecific nature of OCT1, polyspecificity can also be used as a tool to better understand the structure-function relationships of this transporter.
• Der organische Kationentransporter OCT1 ist stark an der sinusoidalen Membran von Hepatozyten exprimiert. OCT1 vermittelt die Aufnahme von schwach basischen und kationischen Substanzen aus dem Blut in die Leber und kann somit den ersten Schritt in der hepatischen Verstoffwechselung oder Exkretion vieler kationischer Medikamente darstellen. OCT1 ist ein polyspezifischer Transporter und hat ein sehr breites Spektrum strukturell sehr unterschiedlicher Liganden (Substrate und Inhibitoren). Der genaue Transportmechanismus und die Aminosäuren, die an der polyspezifischen Ligandenbindung von OCT1 beteiligt sind, sind noch nicht ausreichend verstanden. Das Ziel dieser Arbeit war es, die Polyspezifität zu nutzen um die Struktur-Funktionsbeziehungen von OCT1 besser zu verstehen und erste Einblicke in potentielle Mechanismen zu gewinnen, die diese Polyspezifität vermitteln können. Dabei haben wir zwei Strategien verfolgt und die Effekte der Variabilität sowohl der Liganden- als auch der Transporterstruktur auf die OCT1 Funktion untersucht. Die Effekte der Ligandenstruktur wurden durch den Vergleich der Aufnahme und der Inhibitionspotenz von strukturell ähnlichen Medikamenten aus der Gruppe der Opioide untersucht. Die Effekte der Transporterstruktur wurden durch den Vergleich von Variabilität bedingt durch natürlich vorkommende genetische Varianten oder artifizielle Mutationen auf die OCT1 Aufnahme und Inhibition von verschiedenen Substraten untersucht. Am wichtigsten jedoch wurden die Effekte von speziesspezifischen Unterschieden in der Variabilität der Transporterstruktur durch den Vergleich der Transportkinetiken zwischen Mensch und Maus OCT1 Orthologen untersucht. Dazu wurden stabile oder transient transfizierte HEK293 Zellen benutzt, die OCT1 oder verschiedenen OCT1 Chimären oder Mutationen überexprimieren. Mit Fokus auf die OCT1 Liganden haben wir die Aufnahme und Inhibitionspotenzen von strukturell ähnlichen Opioiden verglichen. Nur kleine Veränderungen der Ligandenstruktur hatten einen starken Einfluss auf die Interaktion mit OCT1. Die Etherverbindung zwischen C4 und C5 des Morphinanrings war mit niedrigen OCT1 Inhibitionspotenzen assoziiert, während die passive Membranpermeabilität die hauptsächliche negative Determinante für die OCT1-vermittelte Aufnahme unter den strukturell sehr ähnlichen Morphinanopioiden war. Nur kleine strukturelle Veränderungen erhöhten die Inhibitionspotenz stark um 28-fach von dem höchsten IC50 von 2004 µM für Oxycodon zu 72 µM für Morphin. Wurde zusätzlich die Etherverbindung zwischen C4-C5 entfernt, so erhöhte sich die Inhibitionspotenz insgesamt um 313-fach zum niedrigsten IC50 von 6 µM für Dextrorphan. Unsere Daten zeigen also, dass die OCT1-vermittelte Aufnahme und die Inhibition dieser Aufnahme trotz der Polyspezifität sehr spezifisch zu sein scheint. Mit Fokus auf die OCT1 Proteinstruktur haben wir zunächst die Effekte der Variabilität durch natürlich vorkommende genetische Varianten auf die OCT1 Aufnahme und Inhibition untersucht. OCT1 genetische Varianten beeinflussten den OCT1 Transport stark und diese Effekte waren oft substratspezifisch. Die Korrelation dieser Effekte ergab einige Substrate, die ähnlich durch die OCT1 Varianten beeinflusst wurden und daher möglicherweise ähnliche oder überlappende Bindungsstellen in OCT1 aufweisen können. Zudem korrelierten die Effekte der genetischen Varianten OCT1*2 und OCT1*3 auf die Aufnahme verschiedener Substrate gut, was darauf hindeuten kann, dass die strukturelle Variabilität durch diese beiden Varianten die OCT1 Aufnahme ähnlich beeinflusst. Die genetischen OCT1 Varianten beeinflussten auch die Inhibition von OCT1 mit sowohl substrat- als auch genotypspezifischen Effekten. Ranitidin inhibierte die Aufnahme mehrerer OCT1 Substrate, darunter die klinisch relevanten Medikamente Metformin und Morphin. Zudem war die Inhibition der Aufnahme vermittelt durch die häufige genetische Variante OCT1*2 potenter (ca. 2-fach) als die der Aufnahme vermittelt durch die Referenz OCT1*1. Desweiteren haben wir die Effekte von artifiziellen Mutationen von Schlüsselaminosäuren untersucht. Tyr222 und Asp475 in Ratten OCT1 hatten starke substratspezifische aber auch speziesspezifische Effekte sowohl auf die OCT1 Aufnahme als auch auf die Inhibition. Mutation dieser Aminosäuren verringerte die OCT1-vermittelte Aufnahme stark, was weiter die wichtige Rolle vor allem von Asp475 unterstreicht. Interessanterweise konnten wir trotz einer vorgeschlagenen essentiellen Rolle dieser Aminosäure einen Asp475-unabhängigen Transport beobachten. Dieser Transport wurde bei Maus aber nicht bei Mensch OCT1 beobachtet und war substratspezifisch. Transmembranhelix (TMH) 10 wurde identifiziert in den Asp475-unabhängigen Transport von Maus OCT1 involviert zu sein. Abschließend und am wichtigsten haben wir die Effekte von Sequenzunterschieden zwischen Mensch und Maus OCT1 auf die Transportkinetik verschiedener OCT1 Substrate untersucht. Die Transportkinetik unterschied sich stark zwischen Mensch und Maus OCT1 Orthologen. Diese Unterschiede waren substratspezifisch und betrafen sowohl die Affinität (KM) als auch die Kapazität (vmax) des Transports. Mensch OCT1 zeigte eine 8-fach höhere Kapazität des Trospiumtransports, wohingegen Maus OCT1 eine 8-fach höhere Kapazität des Fenoteroltransports zeigte. Weiterhin zeigte Maus OCT1 eine 5-fach höhere Affinität zu Metformin als Mensch OCT1. Der Unterschied zwischen Phe32 in Mensch und Leu32 in Maus OCT1 in TMH1 wurde als Auslöser für eine höhere Transportkapazität von Mensch als von Maus OCT1 identifiziert, während der Unterschied zwischen Cys36 in Mensch und Tyr36 in Maus OCT1 in TMH1 als Auslöser für eine höhere Transportkapazität von Maus als von Mensch OCT1 identifiziert wurde. Zudem wurde Leu155 in Mensch OCT1, das zu Val156 in Maus OCT1 korrespondiert, in TMH2 zusammen mit TMH3 als Auslöser für die Unterschiede in der Affinität zu Metformin zwischen den Spezies identifiziert. Es kann spekuliert werden, dass die Ligandenbindung in OCT1 eine Kernbinderegion involviert, die Asp475 beinhaltet und dass die polyspezifische Ligandenbindung durch die Bereitstellung von weiteren Bindungspartnern (anderen Aminosäuren) in periphereren Regionen ermöglicht wird, mit denen die unterschiedlichen Liganden selektiv interagieren können. Solch ein Mechanismus könnte auch ein erster Schritt sein, die substratspezifischen Effekte von OCT1 genetischen Varianten zu erklären. Basierend auf unseren Daten könnten diese „Polyspezifitätsregionen“ TMH1, TMH2 und TMH3 umfassen. Weitere Untersuchungen werden benötigt um diese Regionen zu charakterisieren und einzugrenzen und die Struktur-Funktionsbeziehungen und damit die Polyspezifität von OCT1 zu enträtseln. Die Variabilität sowohl der Liganden- als auch der Transporterstruktur beeinflusst die Funktion von OCT1 stark. Wir konnten Ligandenstrukturen identifizieren, die die Inhibitionspotenz beeinflussen, sowie Proteinstrukturen, die speziesspezifische Unterschiede im OCT1 Transport bedingen. Diese Arbeit unterstreicht die Komplexität des OCT1 Transports und der Struktur-Funktionsbeziehungen. Trotz der Schwierigkeiten für die experimentelle Analyse und Dateninterpretation die sich aus der Polyspezifität von OCT1 ergeben, konnten wir hier zeigen, dass die Polyspezifität auch als Werkzeug genutzt werden kann um die Struktur-Funktionsbeziehungen dieses Transporters besser zu verstehen.