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Giuliana Bruno

• Cold atmospheric-pressure plasmas are candidate biomedical tools proposed for various applications, such as biological decontamination, cancer regression, and promotion of wound healing. Plasmas, which are in the fourth state of matter, can be generated using inert gases (e.g., argon, helium, ambient air) and different source concepts. Together with the applied parameters, the source design defines the chemical-physical characteristics of the resulting plasma, leading in turn to variable biochemical effects on biological matter. The medical effectiveness of cold plasmas has been proven in vitro and in vivo, also in clinical trials for wound healing in patients using two certified plasmas sources, the kINPen MED and the PlasmaDerm. However, molecular mechanisms leading to those effects are unclear. In the same way, it must be studied if the modulation of plasma properties could improve the specificity of biological effects. These findings are needed to define the concept of plasma dose to be optimized in targeting peculiar pathologic conditions. The present thesis consisting of five peer-reviewed publications has investigated these aspects of plasma research. In the gaseous phase of cold plasmas, various components with biological activity are produced, such as radiation (e.g., vacuum UV, UV) and reactive species (e.g., •O, 1O2, •OH, •NO, •NO2, O3). As most gaseous species are short-lived, liquid compartments surrounding cells and molecular structures could mediate their transformation and/or the production of other aqueous species. For this reason, plasma-induced aqueous chemistry has been mainly investigated in this thesis. The reaction pathways of reactive oxygen and nitrogen species in liquid were analyzed by monitoring the oxidative modifications induced on tyrosine and cysteine, which are biological structures essential in cellular protein functioning. Liquid chromatography and mass spectrometry-based strategies have been elaborated to elucidate structural changes and characterize the oxidative pattern occurring on the tracers after treatment with plasmas. As a first result, it could be shown that the oxidative pattern induced on tyrosine or cysteine variated qualitatively and quantitatively with the applied conditions, reflecting the action of differently produced/deposited species in liquid. Biologically relevant structures were identified and in part quantified (e.g., cystine, sulfonic acid, sulfinic acid, S-sulfonate, S-nitrosocysteine, nitrotyrosine, nitrosotyrosine). By using isotopically labeled oxygen or nitrogen in the gas plasma, or labeled oxygen in the target liquid, the incorporation of gaseous or aqueous species in the tracer’s structures was monitored via mass spectrometry. With this strategy, the reaction mechanisms involving gaseous oxygen and nitrogen species at the liquid interface were clarified, as well as the de novo production of reactive species in liquid. Short-lived gaseous oxygen species such as atomic and singlet oxygen (•O, 1O2), predominantly formed in conditions with oxygen in the plasma gas, were able to modify the cysteine structures in highly oxidized derivatives, such as cysteine sulfonic acid. Due to their half-life, however, their activity occurred mainly at the interface. Vacuum UV radiation and •O also led to the formation in liquid of hydroxyl radicals (•OH) and hydrogen peroxide (H2O2), due to water photolysis and homolysis. Water-derived species were responsible for the formation of reversible modifications, such as cysteine S-sulfonate, cystine, and cystine sulfoxides. Nitrosative modifications (e.g., S-nitrosocysteine, nitrosotyrosine, nitrotyrosine) could be observed only in conditions with both nitrogen and oxygen in the plasma gas, and further optimization occurred in presence of water molecules in the gas. In this case, the formation and action of peroxynitrite (ONOO-) in generating nitrotyrosine was proven by using a scavenger molecule for ONOO-. Finally, the cysteine product pattern was applied as a tool to characterize and compare the overall chemistry generated in liquid by different plasma sources and applied parameters. These findings aim to support and contribute to the definition of plasma dose for plasma medicine, through the standardization, control, tuning, and optimization of plasma parameters and plasma liquid chemistry. These results may be applied in the future to improve the specificity and selectivity of the biological effects generated by the described atmospheric-pressure plasma jets.
• Kalte Atmosphärendruckplasmaquellen sind biomedizinische Instrumente, die für verschiedene Anwendungen, wie z. B. für biologische Dekontamination, Behandlung von Krebszellen und Förderung von Wundheilungsstörungen, genutzt werden. Plasma, welches den vierten Aggregatzustand darstellt, wird mit Inertgasen (z. B. Argon, Helium oder Umgebungsluft) und verschiedenen Quellenkonzepten erzeugt. Zusammen mit den genutzten Parametern des Plasmas, definiert das Design der Plasmaquelle die chemisch-physikalischen Eigenschaften des eingesetzten Plasmas, was wiederum zu variablen biochemischen Auswirkungen auf biologische Proben führt. Die medizinische Wirksamkeit von kalten Plasmen wurde in vitro und in vivo nachgewiesen. Auch klinische Studien zur Wundheilung an Patienten haben dies mit zwei zertifizierten Plasmaquellen, dem kINPen MED und dem PlasmaDerm belegen können. Die molekularen Mechanismen, die zu diesen Effekten führen, sind jedoch noch unklar. Ebenso muss untersucht werden, ob durch die Änderung der Plasmaeigenschaften die biologischen Effekte für gezielte Fragestellungen optimiert werden kann. Diese Erkenntnisse werden benötigt, um das Konzept der Plasmadosis zu definieren, welches für die Behandlung pathologischer Zustände zwingend notwendig ist. Die vorliegende Arbeit, die aus fünf, von Experten begutachteten, Veröffentlichungen besteht, hat diese Aspekte der Plasmaforschung untersucht. In der Gasphase kalter atmosphärischer Plasmen gibt es verschiedene Bestandteile mit biologischer Aktivität, wie zum Beispiel Strahlung (z. B. Vakuum-UV, UV) oder reaktive Spezies (z. B. •O, 1O2, •OH, •NO, •NO2, O3). Die meisten gasförmigen reaktiven Spezies sind kurzlebig und formen sich in sekundär Reaktionen zu weiteren reaktiven Spezies in der wässrigen Phase um. Dies ist möglich, da Zellen von verschiedenen flüssigen Bereichen umgeben sind. Aus diesem Grund wurde in dieser Arbeit hauptsächlich die plasmainduzierte wässrige Chemie untersucht. Die Reaktionswege reaktiver Sauerstoff- und Stickstoffspezies in Flüssigkeiten wurden dabei analysiert, indem die oxidativen Modifikationen untersucht wurden, welche an den beiden Aminosäuren Tyrosin und Cystein durch die Plasmabehandlung angebracht wurden. Diese beiden Aminosäuren wurden ausgewählt, da sie für die Funktion von zellulären Proteinen entscheidend sind. Auf Flüssigkeitschromatographie und Massenspektrometrie basierende Strategien wurden entwickelt, um strukturelle Veränderungen der Aminosäuren aufzuklären und das Muster von Oxidationen zu charakterisieren, welches nach Behandlung mit den Plasmen auftrat. Als erstes Ergebnis wurde gezeigt, dass das induzierte Oxidationsmuster von Tyrosin und Cystein qualitativ und quantitativ mit den genutzten Bedingungen variiert. Dies spiegelt die verschiedenen produzierten Spezies in der Flüssigkeit wider. Biologisch relevante Strukturen wurden identifiziert und teilweise quantifiziert (z. B. Cystin, Sulfonsäure, Sulfinsäure, S-Sulfonat, S-Nitrosocystein, Nitrotyrosin, Nitrosotyrosin). Durch die Verwendung von isotopenmarkiertem Sauerstoff oder Stickstoff im Gasplasma oder aber auch markiertem Sauerstoff in der zu behandelnden Flüssigkeit, wurde der Einbau gasförmiger oder wässriger Spezies in den Strukturen der Aminosäuren mittels Massenspektrometrie nachgewiesen. Mit dieser Strategie wurden die Reaktionsmechanismen aufgeklärt, an denen sowohl gasförmige Sauerstoff- und Stickstoffspezies an der Flüssigkeitsgrenzfläche beteiligt sind, als auch die De-novo-Synthese reaktiver Spezies in der Flüssigkeit. Kurzlebige gasförmige Sauerstoffspezies wie atomarer oder Singulett-Sauerstoff (•O, 1O2), welche überwiegend unter Bedingungen mit Sauerstoff im Plasma gebildet werden, konnten das Cystein in hochoxidierte Derivate wie Cysteinsulfonsäure modifizieren. Aufgrund der Halbwertszeit dieser Moleküle, trat ihre Aktivität jedoch hauptsächlich an der Grenzfläche auf. Vakuum-UV-Strahlung und •O führten aufgrund von Wasserphotolyse und -homolyse zur Bildung von Hydroxylradikalen (•OH) und Wasserstoffperoxid (H2O2). Aus dem Wasser stammende reaktive Spezies, waren für die Bildung reversibler Modifikationen wie Cystein-S-Sulfonat, Cystin und Cystinsulfoxide verantwortlich. Nitrosative Modifikationen (z. B. S-Nitrosocystein, Nitrosotyrosin, Nitrotyrosin) konnten nur bei Bedingungen beobachtet werden, bei denen sowohl Stickstoff als auch Sauerstoff im Plasma vorhanden waren. Eine weitere Optimierung erfolgte in Gegenwart von Wassermolekülen im Gas des Plasmas. Hierbei wurde die Bildung von Peroxynitrit (ONOO-) durch die Erzeugung von Nitrotyrosin nachgewiesen. Dies war durch die Verwendung eines Scavenger-Moleküls für ONOO- möglich. Schließlich wurde das Muster der Oxidationsprodukte des Cysteins für die Charakterisierung und zum Vergleich der Gesamtchemie genutzt, um die in der Flüssigkeit erzeugten Spezies durch verschiedene Plasmaquellen und angewandte Parameter zu untersuchen. Diese hier gefundenen Ergebnisse können in Zukunft dazu beitragen eine Definition für eine Dosis Plasma in der Plasmamedizin zu finden und dabei helfen, Parameter für die Plasmaflüssigkeitschemie bezogen auf die Standardisierung, Steuerung und Abstimmung zu optimieren.