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Svea Matthiesen

• Der Erreger des Q-Fiebers ist C. burnetii, ein zoonotisches intrazelluläres Bakterium. Die Gram-negativen Coxiellen kommen in zwei verschiedenen antigenen Lipopolysaccharid (LPS)-Formen vor: als virulente Ph I-LPS- und/oder avirulente Ph II-LPS-Bakterien. C. burnetii wird durch Kontakt mit infizierten Tieren sowie infektiösen Stäuben übertragen. Akute fiebrige Infektionen können beim Menschen im weiteren Verlauf eine Pneumonie oder Hepatitis auslösen. Zu einem geringen Prozentsatz entstehen chronische Infektionen mit persistierenden Coxiellen. Eine C. burnetii-Infektion bewirkt sowohl eine humorale als auch zelluläre Immunantwort. Neben Monozyten und Makrophagen dienen auch dendritische Zellen (DCs) den Coxiellen als geeignete Wirtszellen. DCs gehören zu den Immunzellen der first-line-of-defense des angeborenen Immunsystems und treten während einer Coxiellen-Infektion ebenso wie die mit ihnen kooperierenden natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) früh mit dem aufgenommenen bakteriellen Pathogen in Kontakt. Durch Antigenpräsentation infizierter DCs wird die für die anti-Coxiellen Abwehr maßgebliche T-Zell-Immunität initialisiert und die nachgeschaltete Immunantwort funktional ausgerichtet. Trotz dieser zentralen Immunfunktion sind die zellulären Vorgänge von DCs während einer C. burnetii-Infektion, insbesondere mit Blick auf die zelluläre Selbstverteidigung gegenüber den vermutlich initial auftretenden Ph II-LPS-Varianten, nicht ausreichend verstanden. Zudem ist bisher nicht hinreichend geklärt, welchen Einfluss FN-γ, das von aktivierten NK-Zellen produziert wird, sowie die Sauerstoffumgebung auf die zelluläre Abwehr infizierter APCs nimmt. Das Forschungsziel dieser Promotionsarbeit war es daher, einen detaillierten Einblick in die Prozesse der Coxiellen-Infektionen von DCs und NK-Zellen zu erhalten und hierbei insbesondere die IFN-γ-Wirkung auf die DC-Pathogen-Wechselwirkung sowohl unter norm- als auch hypoxischen Bedingungen zu untersuchen. Die im ersten Teil der Promotionsarbeit durchgeführten zellbiologischen, immunologischen und proteinbiochemischen Analysen im murinen Zellsystem belegen eine pathogenausgelöste Subversion der funktionalen Aktivierung/Induktion der MHC I-Antigenpräsentation Coxiellen-infizierter DCs. Die infektionsbedingte Beeinträchtigung der MHC-Antigenpräsentation infizierter DCs lässt sich in direkter Weise auf einen autokrinen Suppressionseffekt des αVβ8-Integrin-aktivierten TGF-β und nicht auf die subversive Wirkung von Coxiellen-LPS als Virulenzfaktor zurückführen. Untersuchungen im Zusammenhang mit IFN-γ zeigen, dass dieses Zytokin in infizierten DCs eine Wiederherstellung der MHC I-Induktion und -Oberflächenexpression bewirkt, welche mit einer funktionalen Prozessierung und MHC-Präsentation pathogener Peptidantigene verbunden ist. Weitere Studien belegen zudem, dass IFN-γ-behandelte DCs in der Lage sind, die Etablierung/Vermehrung intrazellulärer Coxiellen negativ zu beeinflussen. Die durchgeführten siRNA- und CRISPR/Cas9-Experimente zeigen, dass die zelluläre Selbstverteidigung infizierter DCs maßgeblich durch das IFN-γ-induzierbare iNOS/NO-System vermittelt wird. Als reaktives Stickstoffradikal scheint Stickstoffmonoxid (NO) sowohl Komponenten der bakteriellen Elektronentransportkette als auch die autophagische Ausbildung und Integrität parasitophorer Vakuolen zu beeinträchtigen. Parallel hierzu schützen sich infizierte DCs über einen metabolischen Wechsel zur aeroben Glykolyse vor mitotoxischer NO-Wirkung und sichern so während der intrazellulären Coxiellen-Eliminierung ihr eigenes Überleben. Weitere Untersuchungen dieser Arbeit belegen zudem, dass auch C. burnetii zu einer entsprechenden Gegenwehr fähig ist. Um der NO-vermittelten Abwehr infizierter DCs entgegenzuwirken, induzieren Coxiellen zur Minderung antibakterieller Radikal-Effekte ihre Cytochrom bd-, Katalase- und SOD-Expression. Infektionsstudien mit T4SS-defekten Coxiellen weisen ferner darauf hin, dass das bakterielle Sekretionssystem vermutlich eine wichtige Rolle bei der Wirksamkeit der NO-vermittelten Abwehr infizierter DCs spielt, da sich Coxiellen ohne intaktes T4SS offensichtlich dem negativen NO-Einfluss entziehen und/oder keine entsprechenden Angriffsziele für NO bieten. Studien C. burnetii-infizierter Makrophagen bestätigen, dass das iNOS/NO-System eine essenzielle antibakterielle Selbstverteidigung von APCs darstellt. So zeigen auch Makrophagen eine deutliche Beeinträchtigung intrazellulärer Coxiellen-Vermehrung unter iNOS-vermittelter NO-Synthese. Die im weiteren Verlauf der Arbeit untersuchten norm- und hypoxischen Infektionsmodelle infizierter DCs lassen vermuten, dass hypoxische Kulturbedingungen die Coxiellen dazu veranlassen, ein sporenähnliches Stadium ohne produktive Vakuolenbildung auszubilden. Diese hypoxische Überlebensform intrazellulärer Coxiellen zeichnet sich durch IFN-γ-Resistenz, eine durch modifizierte Genexpression optimierte Sauerstoffverwertung und Radikalentgiftung sowie die Erhaltung ihrer Infektiosität aus. Dies deutet darauf hin, dass Hypoxie den intrazellulären Coxiellen weitere Möglichkeiten zur effizienten Immunevasion eröffnet, die einen unentdeckten Bakterienverbleib innerhalb infizierter Wirtszellen begünstigt und so vermutlich chronische C. burnetii-Infektionen fördert. Für die Synthese und Freisetzung des APC-stimulierenden IFN-γ sind im Zuge angeborener Immunität vor allem die mit DCs kooperierenden NK-Zellen verantwortlich. Die im zweiten Teil dieser Promotionsarbeit durchgeführten Studien zur Charakterisierung der Interaktion zwischen NK-Zellen und Coxiellen belegen, dass NK-Zellen von C. burnetii infiziert werden, sie jedoch die Etablierung und Replikation internalisierter Bakterien durch Ausschleusung in die extrazelluläre Umgebung unterbinden. Dieser Prozess geht mit einer funktionalen NK-Zell-Aktivierung einher, welche durch Phospho-Aktivierung der PKC ϴ sowie IFN-γ- und Granzym B-Ausschüttung charakterisiert ist. Verschiedene mikroskopische Analysen zeigen zudem, dass die intrazellulären bakteriellen Strukturen in unmittelbarem Kontakt mit den sekretorischen Granula stehen und die Coxiellen-Freisetzung über Degranulierung infizierter NK-Zellen erfolgt. Der Abtötung innerhalb der sekretorischen Granula infizierter NK-Zellen scheint sich C. burnetii durch seine Säure- und Protease-Resistenz zu entziehen. Freigesetzte Coxiellen erhalten nach Degranulierung größtenteils ihre Integrität und Fähigkeit zur Infektion benachbarter Wirtszellen. Obschon Coxiellen der Eliminierung durch die sekretorischen Granula entgehen und dies eine kritische Achillesferse der angeborenen Immunantwort darstellt, verbleibt über das gleichzeitig ausgeschüttete IFN-γ infizierter NK-Zellen ein positiver Effekt auf die antibakterielle APC-Aktivität. In ihrer Gesamtbetrachtung tragen die erzielten Ergebnisse dieser Promotionsarbeit zu einem besseren und tieferen Verständnis der C. burnetii-Infektion von DCs und NK-Zellen bei und geben neue Einsichten in die zelluläre Selbstverteidigung sowie die IFN-γ-basierte Immunkooperation innerhalb der frühen Phase der anti-Coxiellen Abwehr. Im weiteren Infektionsverlauf können jedoch diese immunologischen Prozesse durch auftretende Hypoxie vermutlich eingeschränkt und die Eliminierung intrazellulärer Coxiellen erschwert sein.
• The causative agent of Q fever is the zoonotic intracellular bacterium Coxiella burnetii. C. burnetii is gram-negative and occurs in two different antigenic forms that differ in the structure of their lipopolysaccharide (LPS): a virulent Ph I LPS form, and an avirulent Ph II LPS form. Transmission to humans occurs through contact with infected animals or contaminated particulates, and causes an acute febrile infection that may progress to pneumonia or hepatitis. A small percentage of cases develop into chronic infections with bacterial persistence. C. burnetii infection induces both a humoral and cellular immune response. In addition to monocytes and macrophages, dendritic cells (DCs) serve as suitable host cells for infection. DCs belong to the first-line-of-defense of the innate immune system and make early contact with C. burnetii during infection, as do the natural killer (NK) cells that functionally cooperate with them. Antigen presentation by infected DCs also initiates the development of T cell immunity, which is critical for defense against C. burnetii, and functionally directs downstream immune responses. Despite this central role in immune function, the cellular processes taking place in DCs during C. burnetii infection, especially regarding cellular self-defense against Ph II LPS variants, are not sufficiently understood. This also holds true for the influence of NK cell produced IFN-γ and the role of the oxygen environment on cellular defense in infected APCs. Therefore, the goal of this thesis was to gain detailed insight into the cellular processes associated with C. burnetii infection of DCs and NK cells, explicitly investigating the effect of IFN-γ on DC-pathogen interaction under both norm- and hypoxic conditions. In the first part of the Ph.D. thesis, cell biological, immunological, and protein biochemical analyses in the murine cell system demonstrated pathogen-triggered subversion of functional activation/induction of MHC I antigen presentation in C. burnetii-infected DCs. This infection-induced impairment of MHC antigen presentation was directly attributed to autocrine suppression by αVβ8-integrin-activated TGF-β, and not to the subversive impact of C. burnetii LPS as a virulence factor. Further experiments also showed that IFN-γ restores MHC I induction and surface expression in infected DCs, ensuring the functional processing and MHC presentation of pathogen-derived peptide antigens. Moreover, IFN-γ-treatment of DCs affected the establishment/multiplication of intracellular C. burnetii, and additional siRNA and CRISPR/Cas9 experiments found that cellular self-defense in infected DCs is mediated to a significant extent by the IFN-γ-inducible iNOS/NO system. As a reactive radical species, nitric oxide (NO) appears to affect components of the bacterial electron transport chain, as well as autophagic compartment formation and the integrity of parasitophorous vacuoles. In parallel, infected DCs protected themselves from the mitotoxic effects of NO through a metabolic switch to aerobic glycolysis, thus ensuring their survival during intracellular C. burnetii elimination. Macrophages also showed a marked impairment of intracellular C. burnetii proliferation under conditions of iNOS-mediated NO synthesis, further confirming that the iNOS/NO system plays a central role in anti-bacterial self-defense in APCs. Further studies in this work, however, demonstrate that C. burnetii is also capable of a counter-defense. To counteract the NO-mediated defense mounted by infected DCs, C. burnetii upregulates its cytochrome bd, catalase, and SOD expression to mitigate the anti-bacterial effects of NO production. Infection studies with C. burnetii lacking a functional Type IV secretion system (T4SS), further indicated that this system probably plays a critical role in the efficacy of the NO-mediated defense of infected DCs. Specifically, bacteria without an intact T4SS apparently evade the negative effects of NO and/or do not present the appropriate targets for anti-bacterial activity of NO. Further, experiments in norm- and hypoxic infection models of DC infection suggest that hypoxic culture conditions induce C. burnetii to form spore-like particles without productive vacuole formation. This survival form of intracellular C. burnetii is characterized by IFN-γ resistance, enhanced oxygen-binding and radical detoxification due to modified gene expression, as well as the retention of infectivity. This suggests that hypoxia provides intracellular C. burnetii with additional opportunities for efficient immune evasion, favoring undetected bacterial presence within infected host cells, and thus presumably promoting chronic C. burnetii infections. NK cells cooperating with DCs are primarily responsible for the synthesis and release of APC-stimulating IFN-γ as part of the innate immune response. Therefore, studies performed in the second part of this thesis characterized the interaction between NK cells and C. burnetii. These experiments demonstrated that also NK cells are infected by C. burnetii. However, these infected NK cells prevent the establishment and replication of internalized bacteria by expelling them into the extracellular environment. This process is accompanied by functional NK cell activation, characterized by phospho-activation of PKC ϴ as well as IFN-γ and granzyme B release. Various microscopic analyses also show that intracellular bacterial structures colocalize with secretory granules and that C. burnetii release occurs via degranulation of the infected NK cells. However, killing within the secretory granules of infected NK cells appears to be evaded by C. burnetii due to its acid and protease resistance. Thus, released C. burnetii largely maintains its integrity and ability to infect neighboring host cells after degranulation. Nonetheless, although C. burnetii escapes elimination by secretory granules, representing a critical Achilles heel of the innate immune response, the release of IFN-γ by infected NK cells still has a positive effect on the anti-bacterial activity of APCs. Taken together, the results presented in this Ph.D. thesis contribute to a better and more in-depth understanding of C. burnetii infection in both DCs and NK cells and provide new insights into the contributions of cellular self-defense and IFN-γ-based immune cooperation during the early phase of anti-C. burnetii defense. At the same time, however, our work also suggests that as the infection progresses these immunological processes may be impaired by hypoxia, and thus the elimination of intracellular C. burnetii may be hindered.