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In vitro-Wachstum und-Differenzierung porciner Skelettmuskelzellen unter dem Einfluss der Isoflavone Genistein und Daidzein

  • Soja gehört aufgrund seines hohen Proteingehaltes seit Jahrtausenden zu den Grundnahrungsmitteln des Menschen. Daneben wird Soja sowohl in Europa als auch in Asien als Ergänzungsfutter in der Tierernährung verwendet. Die enthaltenen Isoflavone verursachen in vivo möglicherweise positive, systemische Effekte, was aus erhöhten Geburtsgewichten sowie dem verbesserten postnatalen Wachstum von Ferkeln abgeleitet wurde. In weiteren Studien, in denen nach Fütterung im Blut der Tiere eine Daidzeinmenge von ca. 1 µmol/l zirkulierte, wurde das Wachstum der Ferkel nicht beeinflusst. Ferner zeigten die Isoflavone Genistein und Daidzein in vitro häufig ambivalente Effekte auf das Wachstum von Maus oder Ratte abgeleiteten Muskelzellkulturen in Abhängigkeit von der Dosis und Einwirkzeit. Die direkte Wirkung der Isoflavone auf das Wachstum und die Differenzierung von Skelettmuskelzellen wurde bisher für das Hausschwein nicht untersucht, obgleich es über sojahaltiges Futter einer kontinuierlichen Zufuhr von Isoflavonen ausgesetzt und eine Beeinflussung des Wachstums aufgrund der zuvor genannten Studien denkbar ist. Zudem wurde bisher die Expression der Östrogenrezeptoren, als mögliche Bindungsorte für Isoflavone, weder auf Protein- noch auf mRNA-Ebene im Skelettmuskel des Schweins beschrieben. Die vorliegende Arbeit verfolgte daher das Ziel, ein in vitro-Modell in Form einer Satellitenzellkultur aus dem M. semimembranosus für die Untersuchung des Muskelwachstums beim Hausschwein zu etablieren. Erstmals sollte daran die direkte Wirkung der Isoflavone Genistein und Daidzein in physiologischen sowie nicht-physiologischen Konzentrationen auf Basisprozesse des exponentiellen Wachstums und der Differenzierung unter Berücksichtigung möglicher wachstumsfaktorvermittelter Regulations¬mechanismen beschrieben werden. Die Isoflavonwirkung auf die DNA-Synthese der Muskelzellen wurde im Vergleich mit den Östrogenen 17beta-Östradiol und Östron sowie in weiteren Versuchen in Kombination mit den Wachstumsfaktoren IGF-I und EGF betrachtet. Für die Bestimmung der Einflüsse von Genistein und Daidzein auf die Proliferation porciner Skelettmuskelzellen wurden die DNA-Syntheserate, der Zellzyklus, Zelltod sowie DNA-Schäden und deren Reparatur nach Entzug der Isoflavone gemessen. Um den Einfluss der genutzten Isoflavone und 17beta-Östradiol auf die Differenzierung der Skelettmuskelzellen zu untersuchen, erfolgte die Bestimmung des Fusionsgrades sowie die Messung der Creatinkinase-Aktivität. Zusätzlich wurde der Proteinmetabolismus als Einbau bzw. Freisetzung von [3H]-Phenylalanin betrachtet. Ferner erfolgte die Untersuchung der Expression der Östrogen- und Tyrosinkinaserezeptoren, EGF-R und IGF-1R, mithilfe der RT-PCR, des Immunoblots und der Immunhistochemie während der Proliferations- und/oder der Differenzierungsphase. Aus dem porcinen M. semimembranosus wurde erfolgreich ein Satellitenzellpool etabliert und erstmals die Expression der Östrogenrezeptoren alpha und beta im porcinen Skelettmuskel und dem davon abgeleiteten Zellpool gezeigt. Die Ergebnisse lassen weiterhin negative Wirkungen der getesteten Isoflavone auf das Muskelzellwachstum in Ferkeln vor allem ab zirkulierenden Serumkonzentrationen von > 1 µmol/l, jedoch keine Effekte der Östrogene auf die Zellproliferation erwarten. IGF-I und EGF erwiesen sich als wirkungsvolle Stimulatoren des porcinen Muskelzellwachstums, was für EGF in der Zellkultur mit serum- und wachstumsfaktorfreiem Medium erstmals gezeigt wurde. Darüber hinaus wirken IGF-I und EGF scheinbar den toxischen Effekten hoher Isoflavondosen entgegen. Dennoch erniedrigte Genistein (100 µmol/l) deutlich die wachstumsfaktorvermittelte DNA-Synthese in porcinen Satellitenzellkulturen. Interessanterweise war unter dem Einfluss nahrungstypischer Daidzeinkonzentrationen (1 und 10 µmol/l) in Kombination mit IGF-I eine signifikante Erhöhung der Zellzahl zu beobachten. In der differenzierenden porcinen Muskelzellkultur verringerten sowohl Östrogene als auch Isoflavone dosisabhängig die Proteinabbaurate. Obgleich Östrogene allgemein beim Schwein nicht als Förderer des Muskelwachstums gelten, haben Östrogene und nahrungstypische Isoflavonkonzentrationen das Potential, den Protein¬metabolismus des porcinen Skelettmuskels zu beeinflussen. Auf der anderen Seite führten hohe Isoflavonkonzentrationen (20; 100 µmol/l) zu einer Abnahme der Proteinmenge und wirkten als Toxine auf die differenzierenden Skelettmuskelzellen. Da das Schwein eine dem Menschen ähnliche Physiologie und einen für die Isoflavone vergleichbaren Metabolismus besitzt, sind die Ergebnisse dieser Arbeit nicht nur für die Tierernährung bedeutsam, sondern ebenso für die Beurteilung der Auswirkungen sojabasierter Babynahrung auf Entwicklungsprozesse beim menschlichen Neugeborenen, was in zukünftigen Untersuchungen zu den Wirkungen der Sojaisoflavone berücksichtigt werden sollte.
  • Due to its high protein content soy has been used for thousands of years as a human staple food. In addition, soy has also been introduced as a common food supplement in livestock production both in Europe and in Asia. Soy isoflavones are supposed to have positive, systemic effects on animal growth, which has been deduced from higher birth weights and improved postnatal growth of piglets. However, in additional studies, piglet growth was not affected after the supplementation of sow food with daidzein in amounts that resulted in a isoflavone serum concentration of 1 µmol/l. Moreover, the isoflavones genistein and daidzein in vitro often reacted ambivalently on the growth of rodent muscle cell cultures, which depended on the exposure time and the concentrations used. However, the direct effects of isoflavones on growth and differentiation of porcine skeletal muscle cells have not been examined, yet. Although the pig is exposed to daily uptake of soy isoflavones, which, regarding to the aforementioned studies, suggests an influence on growth to be likely. Furthermore, the expression of estrogen receptors, as possible targets for isoflavonic action, has not been demonstrated for porcine skeletal muscle, neither at the mRNA nor at the protein level. Therefore, the aim of this study was to establish a primary cell culture from semimembranosus muscle as an in vitro model for muscle growth in the pig. For the first time, direct effects of physiological and non-physiological concentrations of genistein and daidzein on basic processes of muscle proliferation and differentiation were examined with regard to possible growth factor-mediated regulatory mechanisms. Moreover, isoflavonic action on DNA synthesis has been determined in comparison with the estrogens 17beta-estradiol and estrone as well as in combination to the growth factors IGF-I and EGF. DNA synthesis, cell cycle, cell death, and DNA damage and repair after removing the isoflavones have been determined to unravel the effects of genistein and daidzein on the proliferation of porcine skeletal muscle cells. To evaluate the impact of the isoflavones used and 17beta-estradiol on skeletal muscle cell differentiation, the grade of fusion and creatine kinase activity were determined. In addition, the protein metabolism was measured as incorporation or release of [3H]-phenylalanine. Furthermore, the expression of estrogen receptors and the receptor tyrosine kinases, EGF-R and IGF-1R, was examined during proliferation and/or differentiation by RT-PCR, immunoblot and immunohistochemistry. A satellite cell pool was successfully derived from semimembranosus muscle of newborn piglets. For the first time, evidence for ERalpha and ERalpha expression in porcine skeletal muscle and derived cells has been provided. Furthermore, the results of this study suggest detrimental effects of the isoflavones used on skeletal muscle cell growth to occur at circulating concentrations of > 1 µmol/l, whereas effects of estrogens on cell proliferation are not expected. IGF-I and EGF effectively stimulated porcine muscle cell growth, which has firstly been demonstrated for EGF using serum- and growth factor-free medium. Moreover, IGF-I and EGF seem to counteract the toxic effects of isoflavones. However, genistein obviously inhibited the growth factor-related DNA synthesis in porcine satellite cell cultures at a concentration of 100 µmol/l. Surprisingly, the combination of IGF-I and daidzein at concentrations that match serum concentrations after consuming soy-based diets (1 and 10 µmol/l), significantly increased cell number. In the differentiating porcine muscle cell culture both estrogens and isoflavones inhibited protein degradation rate in a dose-dependent manner. Although estrogens are commonly not considered to promote muscle growth, both estrogens and isoflavone concentrations typical for soy feed potentially affect protein metabolism in porcine skeletal muscle. On the other hand, high isoflavone concentrations (20; 100 µmol/l) exert detrimental effects on differentiating muscle cells by the reduction of total protein. Since the pig approximates the human physiology and metabolism for dietary isoflavones, the results of this study might be useful not only for animal nutrition but also to evaluate isoflavonic effects of soy-based infant formulas on the development of newborn children, which should be considered in future research on soy-derived isoflavones.

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Metadaten
Author: Marcus Mau
URN:urn:nbn:de:gbv:9-000466-4
Title Additional (English):In vitro growth and differentiation of porcine skeletal myoblasts under the influence of genistein and daidzein
Advisor:Prof. Dr. Werner Kloas, Steffen Maak, Prof. Dr. Jan-Peter Hildebrandt
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2008/02/23
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2008/02/08
Release Date:2008/02/23
Tag:DNA-Schäden, Myoblasten, Rezeptortyrosinkinasen, Soja, Zelltod
DNA repair, estrogens, isoflavones, porcine myoblasts, soy
GND Keyword:Isoflavone, Schwein, Skelettmuskel, Zellkultur, Östrogene
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Zoologisches Institut und Museum
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 590 Tiere (Zoologie)