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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-000915-0

Charakterisierung des extrazellulären Proteoms von Staphylococcus aureus und Analyse der Wirt-Pathogen Interaktionen bei der Infektion humaner Epithelzellen mit Staphylococcus aureus

  • Staphylococcus aureus ist ein ubiquitär verbreitetes Bakterium. Häufig als Kommensale des Menschen vorkommend, zählt das Bakterium jedoch zu einem der wichtigsten Infektionserreger des 21. Jahrhunderts. Neben lokalen Infektionen (z. B. Furunkel) kann der Erreger nach einer Besiedlung auch systemische Erkrankungen in seinem Wirt (z. B. Sepsis, Endokarditis, Pneumonie) hervorrufen. Die pathogene Wirkung von S. aureus ist auf die Produktion und Sekretion von Pathogenitäts- bzw. Virulenzfaktoren, unter anderem Superantigene, hämolytische Toxine, Gewebe-zerstörende Enzyme und Oberflächenproteine, welche ihrerseits mit dem Immunsystem des Wirtes interferieren, zurückzuführen. Ziel dieser Arbeit war unter anderem die Analyse des extrazellulären Proteoms von S. aureus RN1HG in pMEM, ein an das bakterielle Wachstum adaptierte Zellkulturmedium. Bei den extrazellulären Proteomanalysen von S. aureus RN1HG konnten 39 Proteine identifiziert werden, welche dem Bakterium eine Interaktion mit dem Wirt (Clumping-Faktoren) ermöglichen, die Phagozytose (Protein A) verhindern oder die Ausbreitung im Gewebe (alpha-Hämolysin, gamma-Hämolysin, Lipase) erleichtern. Da die Zusammensetzung des extrazellulären Proteoms durch diverse Regulons (z. B. agr-System, sarA, sigB) bestimmt wird, stellte sich die Frage, inwiefern diese einen Einfluss auf die Virulenz des Stammes RN1HG-Stamm haben. Ein vielfach in der Literatur diskutierter Regulator ist SigB. Die vergleichende gelfreie LC-MS/MS-Analyse des extrazellulären Proteoms von S. aureus RN1HG mit einer sigB Deletion (RN1HG delta sigB) zeigte, dass sich im Vergleich zum Wildtyp die Zusammensetzung des extrazellulären Proteoms nicht grundsätzlich ändert. Jedoch konnte durch eine „labelfreie“ Quantifizierung eine verstärkte Akkumulation zahlreicher Virulenzfaktoren (z. B. Aureolysin, 1-Phosphatidylinositol- Phosphodiesterase, alpha-Hämolysin, gamma-Hämolysin, Lipase, Thermonuklease) in der delta sigB Mutante nachgewiesen werden. Die Serin-Proteasen A, C und E konnten nur für die delta sigB Mutante identifiziert werden. Adhäsine, darunter Clumping-Faktoren oder Elastin-Bindeprotein, wurden lediglich während der exponentiellen Wachstumsphase für die delta sigB Mutante nachgewiesen. Dies konnte für clf auch durch Transkriptomanalysen belegt werden. Die gelfreien Analysen wurden durch gelbasierte Verfahren (2D-Gelelektrophorese) ergänzt. Neben der Erstellung einer Referenzkarte des extrazellulären Proteoms von S. aureus RN1HG (Wildtyp und delta sigB Mutante) wurden quantitative gelbasierte Daten erhoben, die einerseits die Ergebnisse der gelfreien Analysen bestätigten, andererseits aber auch zeigten, dass SigB nur wenig Einfluss auf die Prozessierung und posttranslationale Modifikation extrazellulärer Proteine in S. aureus RN1HG hat. Die Zusammensetzung des extrazellulären Proteoms ist vor allem bei pathogenen Bakterien bedeutsam, da z. B. durch extrazelluläre Enzyme die Erschließung von Nährstoffquellen in extremen Habitaten begünstigt und durch Virulenzfaktoren sowohl die Kolonisierung als auch die Überlebensfähigkeit im Wirtsorganismus gesichert wird. Um die Erreger-Wirt Interaktion näher zu charakterisieren, wurde die Reaktion von humanen bronchialen Epithelzellen (S9-Zellen) auf eine Infektion mit S. aureus RN1GH pMV158 untersucht. Die Durchführung der Infektionsstudien mit einem GFP-markierten RN1HG-Stamm ermöglichte die Sortierung der infizierten S9-Zellen durch die Durchflusszytometrie. Da im Epithelverband nicht jede Zelle mit S. aureus infiziert ist, lag der Vorteil der Sortierung darin, dass Proteomanalysen spezifisch für die S9-Zellen mit internalisierten Staphylokokken durchgeführt werden konnten. Infolge einer Internalisierung von S. aureus durch die S9-Epithelzellen kam es zunächst zu einer Integrin-vermittelten Adhäsion. Eine zunehmende Inkubation mit S. aureus führte zu inflammatorischen Prozessen. Die Invasion pathogener Bakterien in Wirtzellen führt somit zum Remodelling biologischer Prozesse, die dem Wirt die Auseinandersetzung mit dem Pathogen ermöglichen.
  • Staphylococcus aureus is an ubiquitous microorganism. Apart from being a permanently colonizer of the human skin, the bacteria is one of the most important pathogen in infection disease of the 21th century. In addition to local infections (e.g. furuncles) the pathogen causes systemic diseases (e.g. septicemia, endocarditis, pneumonia). The pathogenicity of S. aureus is based on the production and secretion of virulence factors, including superantigens, hemolysines, tissue-disruptive enzymes and surface proteins, inferring with the immune system of the host. One aim of this project was the analysis of the extracellular proteome of S. aureus RN1HG in pMEM, an eukaryotic cell culture media adapted to bacterial growth. The analysis of the extracellular proteome analysis of S. aureus RN1HG revealed 39 proteins, which are involved in the interaction with the host (clumping-factors), avoiding the phagocytosis (protein A) or facilitating the bacterial spread (alpha-hemolysin, gamma-hemolysin, lipase). Since the composition of the extracellular proteome depends on different regulons (e.g. agr-system, sarA, sigB) their influence on the impact of virulence in the strain RN1HG has to be examined. One of the most important regulon is SigB. A comparative gelfree LC-MS/MS analysis of the extracellular proteome of S. aureus RN1HG and its sigB deletion mutant (RN1HG delta sigB) revealed that the composition of the extracellular proteome is not significantly different. However, “labelfree” quantification of the proteins displayed an increased accumulation of virulence factors (e.g. aureolysin, 1-phosphatidylinositol-phosphodiesterase, alpha-hemolysin, gamma-hemolysin, lipase, thermonuclease) in the delta sigB mutant. Serine proteases A, C and E were only identified in the delta sigB mutant. Adhesion proteins, among them clumping-factors or elastin binding protein, were detected during the exponential growth phase in the delta sigB mutant. For clf the data were confirmed on transcriptome level. Additionally, classical gelbased approaches (2D-gelelectrophoreses) were established. Besides a reference map of the extracellular proteome of S. aureus RN1HG (wildtype and delta sigB mutant) quantitative analyses were performed, confirming the results from gelfree analysis and showing only little influence of SigB on the processing and posttranslational modification of extracellular proteins in S. aureus RN1HG as well. The composition of the extracellular proteome is mainly important for pathogenic bacteria in facilitating the exploitation of nutrients in extreme habitats through extracellular enzymes or saving the colonization as well as the survival in host organisms. For a detailed characterization of the host-pathogen interaction, the reaction of human bronchial epithelial cells (S9-cell line) after infection with S. aureus RN1HG pMV158 was examined. The use of a GFP-labeled RN1HG strain in the infection experiments allowed the sorting of S9 infected cells via flow cytometry. Since not every cell in a cell layer was infected with S. aureus, the sorting enabled a particular proteomic analysis of S9-cells with internalized staphylococci. As a result of bacterial infection, in the S9-cells an integrin-mediated adhesion was observed in the beginning whereas a prolonged incubation with S. aureus lead to inflammatory processes. In conclusion the data show, that the invasion of pathogenic bacteria leads to a remodeling of biological processes in the host cells displaying a protective response of the host against the pathogen.

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Metadaten
Author: Melanie Gutjahr
URN:urn:nbn:de:gbv:9-000915-0
Title Additional (English):Characterization of the extracellular proteome of Staphylococcus aureus and analysis of the host-pathogen interaction after infection of human epithelial cells with Staphylococcus aureus
Advisor:Prof. Dr. rer. nat. Uwe Völker
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2011/02/09
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2010/12/10
Release Date:2011/02/09
Tag:extrazelluläres Proteom, labelfreie Quantifizierung
extracellular proteome, labelfree quantification
GND Keyword:Infektion, Proteomanalyse, Staphylococcus aureus
Faculties:Universitätsmedizin / Arbeitsgruppe "Funktionelle Genomforschung"
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie