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Una Janke

• Blood platelets are primary major players in the coagulation cascade, that act upon damage in blood vessels at the subendothelial surface. During this process, platelets change their shape, release granules and aggregate by cross-linking of integrin αIIbβ3 via fibrinogen. The heterodimeric transmembrane receptor integrin αIIbβ3 is highly expressed on platelets and its regulation is bidirectional. Inside-out signaling leads to increased affinity for ligands due to dramatic rearrangements in the integrin conformation changing from an inactive bent conformation to an extended, high-affinity conformation. The swing-out motion of the integrin head domain enables binding of ligands, e.g. fibrinogen, resulting in outside-in signaling guiding kinase activation, shape change, platelet aggregation and spreading, subsequently. Agonists (e.g. thrombin) and other triggers (e.g. shear stress) promote the activity of platelets, making the study of specific proteins delicate. Therefore, this PhD thesis describes a biomimetic system used to study αIIbβ3 membrane receptors. Integrin αIIbβ3 was successfully reconstituted into liposomes and characterized by biophysical and molecular biological methods (e.g. dynamic light scattering, transmission electron microscopy, circular dichroism spectroscopy and flow cytometry). The fusion of liposomes to a solid substrate allows the analysis of potential activation triggers and interaction partners concerning their role in integrin αIIbβ3 activation in a lipid bilayer. Among others, quartz-crystal microbalance measurements show that divalent ions and clinically relevant drugs (e.g. unfractionated heparin and quinine), known to be involved in immune thrombocytopenia (ITP), are certainly candidates which induce integrin activation and minor changes in protein secondary structure. In addition, protein corona formation during contact of nanoparticles with blood components, such as fibrinogen, as well as their interaction with artificial platelet model membranes containing integrins were studied. Moreover, lipid environment can be strongly controlled as integrin activation is dependent on the ratio of liquid-ordered and disordered phases within the membrane. Eventually, by exclusion of disturbances of complex external and internal factors, the established system enables the interaction analysis of various substances with receptors under physiological conditions. In contrast, these disturbances are required to understand the complex machinery of cellular processes in vivo. Hence, an expression platform, on the basis of HEK293 cells, was established to study not only the interaction of integrin αIIbβ3 with cytoskeletal networks, but also the impact of mutations on integrin resulting in a disease-like phenotype. Mutations known to induce Glanzmann thrombasthenia (GT) symptoms, were introduced and led to different mechanical properties of integrin-expressing cells, especially during cell adhesion cells. Thereby, generation of biological and medically-relevant processes combined with the biophysical setup contribute to understand disease mechanisms as well as the action of therapeutic agents in diseases such as GT and ITP.
• Blutplättchen sind die Hauptakteure in der Gerinnungskaskade, die auf Schäden in Blutgefäßen an der subendothelialen Oberfläche einwirken. Während dieses Prozesses ändern Blutplättchen ihre Form, setzen Granula frei und aggregieren durch Vernetzung des Integrins αIIbβ3 und Fibrinogen. Der heterodimere Transmembranrezeptor Integrin αIIbβ3 wird auf Blutplättchen exprimiert und seine Regulation ist bidirektional. Inside-Out-Signale führen zu einer erhöhten Affinität für Liganden aufgrund dramatischer Umlagerungen in der Integrin Konformation, die sich von einer inaktiven geschlossenen Konformation zu einer gestreckten Konformation mit hoher Affinität ändern. Die Ausschwenkbewegung der Integrin Kopfdomäne ermöglicht die Bindung von Liganden, z.B. Fibrinogen, was zur Aktivierung von Singalkaskaden, einer Blutplättchen Aggregation und einer anschließenden Ausbreitung führt. Agonisten (z. B. Thrombin) und andere Trigger (z. B. Scherbeanspruchung) fördern die Aktivität von Blutplättchen, wodurch die Untersuchung spezifischer Proteine schwierig wird. Diese Doktorarbeit zeigt ein biomimetisches System zur Untersuchung von αIIbβ3-Membranrezeptoren. Integrin αIIbβ3 wurde erfolgreich in Liposomen rekonstituiert und durch biophysikalische und molekularbiologische Verfahren (z. B. dynamische Lichtstreuung, Transmissionselektronenmikroskopie, Zirkulardichroismus-Spektroskopie und Durchflusszytometrie) charakterisiert. Die Fusion von Liposomen mit einem festen Substrat ermöglicht die Analyse potenzieller Aktivierungsauslöser und Interaktionspartner hinsichtlich ihrer Rolle bei der Aktivierung des Integrins αIIbβ3 in einer Lipiddoppelschicht. Quarzkristall-Mikrowaagen Messungen zeigen unter anderem, dass zweiwertige Ionen und klinisch relevante Arzneimittel (z. B. unfraktioniertes Heparin und Chinin), von denen bekannt ist, dass sie an der Immunthrombozytopenie (ITP) beteiligt sind, zweifellos Kandidaten sind, die eine Integrin-Aktivierung und geringfügige Änderungen der Proteinsekundärstruktur induzieren. Darüber hinaus wurden die Bildung von Proteinkorona beim Kontakt von Nanopartikeln mit Blutbestandteilen wie Fibrinogen, sowie deren Wechselwirkung mit artifiziellen Integrin Thrombozyten-Modellmembranen untersucht. Darüber hinaus kann die Lipidumgebung gesteuert werden, da die Integrin-Aktivierung auch vom Verhältnis der geordneten und ungeordneten Phasen innerhalb der Membran abhängt. Unter Ausschluss von Störungen komplexer externer und interner Faktoren, ermöglicht das etablierte System schließlich die Interaktionsanalyse verschiedener Substanzen mit Rezeptoren unter physiologischen Bedingungen. Im Gegensatz dazu sind eben diese „Störungen“ erforderlich, um die komplexe Maschinerie zellulärer Prozesse in vivo zu verstehen. Daher wurde eine Expressionsplattform auf der Basis von HEK293-Zellen eingerichtet, um nicht nur die Wechselwirkung von Integrin αIIbβ3 mit dem Zytoskelett zu untersuchen, sondern auch den Einfluss von Mutationen des Integrins, was zu einem krankheitsähnlichen Phänotyp führt. Mutationen, von denen bekannt ist, dass sie Glanzmann-Thrombasthenie (GT)-Symptome induzieren, wurden eingebracht und führten zu unterschiedlichen mechanischen Eigenschaften von Integrin-exprimierenden Zellen, insbesondere während der Zelladhäsion. Dadurch trägt die Erzeugung biologischer und medizinisch relevanter Prozesse in Kombination mit dem biophysikalischen Aufbau dazu bei, die Krankheitsmechanismen sowie die Wirkung von Therapeutika bei Krankheiten wie GT und ITP zu verstehen.