Open Access

Ulrike Giesen

• Der Sepsis sowie einer Reihe von Autoimmunerkrankungen wie Multipler Sklerose und Diabetes mellitus Typ 1 ist, ebenso wie zahlreichen weiteren Krankheitsbildern, gemein, dass für diese eine Beteiligung der induzierbaren Stickstoffmonoxid-Synthase (iNOS) an deren Pathogenese durch exzessive Freisetzung von Stickstoffmonoxid bewiesen ist bzw. diskutiert wird. Die Auffindung von effektiven und selektiven Inhibitoren der iNOS stellt einen möglichen, erfolgversprechenden Ansatz dar, zumindest die Symptomatik dieser Erkrankungen positiv zu beeinflussen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollten neue Wirkstoffe als potentielle Inhibitoren der iNOS zugänglich gemacht und auf ihre Aktivität getestet werden. Ein wesentlicher Ansatzpunkt für das Wirkstoff-Design ist die strukturelle Modifikation des natürlichen Substrats der iNOS, der Aminosäure Arginin. Ein bekannter Arginin analoge Hemmstoff der iNOS ist Aminoguanidin. Das Konzept der vorliegenden Arbeit zur strukturellen Abwandlung dieses Moleküls beinhaltete dessen Integration in ein heterobicyclisches System, mit dem Ziel, die Flexibilität der Aminoguanidin-Struktur herabzusetzen, um somit die Hemmwirkung und die iNOS-Spezifität zu verbessern. Die bisher wenig erschlossene Verbindungsklasse der [1,2,4]Triazolo[1,2-a]pyridazine erschien sehr gut geeignet, dieses Konzept zu realisieren. So wurden verschieden substituierte Vertreter dieses Grundkörpers als Analoga zu Aminoguanidin dargestellt. Als Hauptsyntheseroute wurde die Darstellung von Hexahydro[1,2,4]triazolo[1,2-a]pyridazinen über Ringschluss von Hexadyro-1-carbothioamid mit Aldehyden / Ketonen verfolgt. Anschließend wurden diese durch S-Methylierung mit Iodmethan zu 1-Methylsulfanyl-5,6,7,8-tetrahydro-3H-[1,2,4]triazolo[1,2-a]pyridazinen umgesetzt und schließlich mittels S-N-Austausch Tetrahydro-3H-[1,2,4]triazolo[1,2-a]pyridazin-1-amine dargestellt. Die erhaltenen Vertreter der Zielverbindungen aller Synthesestufen wurden auf ihre Aktivität gegenüber der induzierbaren Stickstoffmonoxid-Synthase und mögliche zytotoxische Effekte mittels eines Zellkultur-Modells getestet. Im Ergebnis der chemisch-synthetischen und strukturanalytischen Arbeiten wurde eine Vielzahl von Verbindungen mit [1,2,4]Triazolo[1,2-a]pyridazin-Struktur einschließlich entsprechender Vorstufen neu- bzw. resynthetisiert. Alle Verbindungen wurden umfassend strukturanalytisch charakterisiert. So war es möglich eine umfangreiche Substanzbibliothek mit diversen Substitutionsmustern zu generieren, welche für die Überprüfung der generellen Eignung von Abkömmlingen des [1,2,4]Triazolo[1,2-a]pyridazins als Inhibitoren der induzierbaren NO-Synthase genutzt werden konnte. Für diese biologischen Untersuchungen zur Inhibition der induzierbaren NO-Synthase (iNOS) durch die synthetisierten Titelverbindungen wurde ein optimiertes Zellkultur-Testverfahren unter Verwendung der Ratten-Insulinom Zelllinie RINm5F für den Arbeitskreis etabliert. Diese wurden mit den proinflammatorischen Zytokinen Interleukin-1β und Interferon-γ zur Expression von induzierbarer NO-Synthase stimuliert. Nach der Inkubation mit den potentiellen Hemmstoffen wurde die verbleibende NO-Produktion der Zellen durch Ermittlung der Nitritkonzentration im Überstand bestimmt. Anschließend wurde an den bereits behandelten Zellen auf mögliche Zytotoxizität der Substanzen durch einen MTT-Assay getestet. Mit diesem Verfahren wurden eine Reihe der Titelverbindungen bezüglich ihrer iNOS-hemmenden und zytotoxischen Eigenschaften untersucht. Davon inhibierten etliche in Position 3 unterschiedlich substituierte [1,2,4]Triazolo[1,2-a]pyridazin-1-thione dem Aminoguanidin vergleichbar oder stärker die NO-Produktion der iNOS bei nur geringem, zytotoxischem Effekt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit ist es gelungen, die Verbindungsklasse der [1,2,4]Triazolo[1,2-a]pyridazine mit einer breiter Palette von Derivaten synthetisch zu erschließen und eine iNOS-inhibierende Wirkung für eine Anzahl von Vertretern zu belegen.
• Sepsis and a number of autoimmune diseases such as multiple sclerosis and type 1 diabetes mellitus, as well as numerous other clinical pictures, have in common that inducible nitric oxide synthase (iNOS) has been proven to be involved in their pathogenesis through excessive release of nitric oxide. The discovery of effective and selective inhibitors of iNOS represents a possible, promising approach to at least positively influence the symptoms of these diseases. Within the scope of the present work, new structures should be made available as potential inhibitors of iNOS and their biological activity should be tested. An essential starting point for drug design is the structural modification of a natural substrate of iNOS, the amino acid arginine. A well-known arginine analogue inhibitor of iNOS is aminoguanidine. The concept of the present work for the structural modification of this molecule included its integration into a heterobicyclic system with the aim of reducing the flexibility of the aminoguanidine structure in order to improve the inhibitory effect and the iNOS specificity. The so far little developed class of compounds of the [1,2,4]triazolo[1,2-a]pyridazine appeared to be very suitable for realizing this concept. Thus, variously substituted representatives of this basic structure were prepared as analogs to aminoguanidine. The main synthetic route included the preparation of hexahydro[1,2,4]triazolo[1,2-a]pyridazines via ring closure of hexadyro-1-carbothioamide with aldehydes / ketones. These were then converted to 1-methylsulfanyl-5,6,7,8-tetrahydro-3H-[1,2,4]triazolo[1,2-a]pyridazines by S-methylation with iodomethane and finally tetrahydro-3H-[1,2,4]triazolo[1,2-a]pyridazin-1-amines are prepared by means of S-N-exchange. The obtained representatives of the target compounds of all synthesis stages were tested for their activity against inducible nitric oxide synthase and possible cytotoxic effects using a cell culture model. As a result of the chemical-synthetic and structural analytic work, a large number of compounds with a [1,2,4]triazolo[1,2-a]pyridazine structure including the corresponding precursors were synthesized or resynthesized. All compounds were characterized extensively by structural analysis. It was thus possible to generate an substantial substance library with various substitution patterns, which were used to evaluate the general suitability of derivatives of the [1,2,4]triazolo[1,2-a]pyridazins as inhibitors of inducible NO synthase. For these biological studies on the inhibition iNOS by the synthesized title compounds, an optimized cell culture test method using the rat insulinoma cell line RINm5F was established for the working group. These cells were stimulated with the proinflammatory cytokines interleukin-1β and interferon-γ to express inducible NO synthase. After incubation with the potential inhibitors, the remaining NO production of the cells was determined by measuring the nitrite concentration in the supernatant. On the already treated cells an MTT assay was carried out to investigate the possible cytotoxicity of the substances. Using this method, a number of the title compounds were examined for their iNOS-inhibiting and cytotoxic properties. Of these, several [1,2,4]triazolo[1,2-a]pyridazine-1-thiones, which were differently substituted in position 3, inhibited the NO production of the iNOS in a manner comparable to or stronger than aminoguanidine with only a slight, cytotoxic effect. In the present work it was possible to synthetically unlock a wide range of derivatives of the class of [1,2,4]triazolo[1,2-a]pyridazines and to prove an iNOS-inhibiting effect for a number of representatives.