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Bob Fregin

• Cell mechanical properties reveal substantial information on cell state and function. Utilizing mechanics as a label-free biomarker allows for investigation of fundamental cellular processes as well as biomedical applications, e.g., disease diagnosis. High-throughput methods for accessing the elastic properties of cells in suspension from hydrodynamic deformation in a microfluidic constriction are available with real-time analysis rates of up to 1000 cells per second. However, accessing elastic as well as viscous properties of cells and multicellular systems in suspension as well as adhered to surfaces at high throughput has not been possible so far. In this thesis, I approached this question and developed as well as applied microfluidic and holographic technologies to analyze the viscoelastic properties of single cells and multicellular aggregates, respectively. First, I demonstrated that real-time deformability cytometry (RT-DC) can be applied in transfusion medicine, where the highest quality standards have to be maintained while blood product release is time-critical. We showed for platelet and red blood cell concentrates as well as for hematopoietic stem cells that their mechanical properties can be used for label-free quality assessment. The results have been published in Lab on a Chip (Aurich et al. 2020). For RT-DC and many other methods based on hydrodynamic deformation, the constriction size has to be adapted to the objects of interest to allow for a shear-induced deformation. We introduced virtual fluidic channels, which are established by two co-flowing aqueous polymer solutions. Virtual fluidic channels can be precisely adjusted in their cross section, allowing for mechanical phenotyping of single cells as well as cell clusters or tissue spheroids in one microfluidic system. Importantly, measurements can also be performed in standard microfluidic geometries beyond soft lithography, e.g., in the cuvette of a flow cytometer. For cell spheroids as a model system for multicellular aggregates, we show a 10-fold lower Young's modulus of the tissue compared to single-cell mechanics, suggesting cell-cell and cell-matrix interactions being potential contributors to the mechanics of multicellular aggregates. Our work on virtual fluidic channels has been published in Nature Communications (Panhwar et al. 2020). Within this thesis, I expanded the high-throughput elastic phenotyping performed by RT-DC towards viscoelastic cell properties by developing dynamic real-time deformability cytometry (dRT-DC). Dynamic tracking of cells while passing the microfluidic constriction allows to access steady-state (elasticity) and time-dependent (viscosity) material properties for a complete viscoelastic characterization of cells in suspension at high throughput. I introduced a shape mode decomposition based on a Fourier transformation, which allows to disentangle the superimposed stress responses to an extensional stress at the channel inlet and a constant shear stress in the channel. These hydrodynamic stress distributions are present in almost every microfluidic channel geometry. From the separated stress responses, viscoelastic material properties can be determined independent of cell shape. We demonstrated experimentally the sensitivity of dRT-DC to cytoskeletal alterations and confirmed the validity of the method by reference measurements on calibrated hydrogel beads. In our work, we also presented a viscoelastic fingerprint of the major subpopulations of peripheral blood: erythrocytes, granulocytes, and peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) (e.g., lymphocytes and monocytes), all characterized by the same method. The technique and the results have been published in Nature Communications (Fregin et al. 2019). In cell mechanical methods based on hydrodynamic deformation, cell shape is usually monitored while a stress is applied. For extraction of material properties as well as for studying shape dynamics, it is essential to describe cell shape yielding highest strain differences for a given microfluidic system and experimental setting. Using dRT-DC, I compared nine different shape descriptors to analyze cell deformation in an extensional as well as shear flow. A relaxation time analysis was performed on different levels of data aggregation from single cells to an ensemble scale. I demonstrated that the steady-state deformation can be predicted from stress response curves without them reaching the steady-state. This is important for cell mechanical measurements in microfluidic systems as the characteristic times are unknown in general and as the channel length is fixed. In addition, by introducing a cut-off criterion for how much of the response trace needs to be captured within the channel, the analysis time per cell can be reduced while material properties can still be extracted. Performing simulations, I compared the accuracy of relaxation times extracted from ensemble and single-cell studies under experimental conditions. Introducing a scoring system to evaluate which combinations of shape descriptors and analysis strategies provide biggest effect size, we concluded that single-cell analyses in an extensional flow are most sensitive to cytoskeletal modifications independent of shape parametrization. The manuscript was submitted to the Biophysical Journal. Finally, I translated the fast non-contact cell mechanical probing from suspension to adherent cells. No such technology has been available and with the majority of cells being adherent, a robust label-free method for mechanophenotyping at high-throughput is required. Within this thesis, I have introduced and realized a new concept: holographic vibration spectroscopy (HVS), where adherent cells are mechanically excited on a vibrating surface while their height oscillations are measured optically. Analysis is done in an interferometric heterodyne setup by using frequency multiplexing and time-averaged holography in off-axis configuration. Based on interference images captured by a high-speed complementary metal-oxide-semiconductor (CMOS) camera, I established a mathematical model to reconstruct the vibration amplitude of adherent cells as well as their retardation phase compared to the exciting vibration. From the amplitude and phase response, viscoelastic parameters can be derived, which have to be investigated in subsequent studies. In summary, I introduced in my work two high-throughput methods for the viscoelastic characterization of suspended as well as adherent cells while highlighting applications in tissue mechanics and transfusion medicine that are relevant not only in basic but also in translational research.
• Die mechanischen Eigenschaften einer Zelle enthalten substantielle Informationen ihres Zustandes und ihrer Funktion. Die Nutzung zellmechanischer Eigenschaften als markierungsfreier Biomarker ermöglicht die Untersuchung grundlegender zellulärer Prozesse sowie den Einsatz in biomedizinische Anwendungen, z. B. zur Krankheitsdiagnose. Zur Messung elastischer Eigenschaften von Zellen in Suspension existieren bereits Hochdurchsatzmethoden mit Analyseraten von bis zu 1000 Zellen pro Sekunde in Echtzeit. Diese basieren auf hydrodynamischer Verformung der Zellen in mikrofluidischen Kanälen. Allerdings war es bisher nicht möglich, sowohl die elastischen als auch die viskosen Eigenschaften von Zellen und mehrzelligen Systemen in Suspension sowie an adhärenten Zellen mit hohem Durchsatz zu quantifizieren. In dieser Dissertation habe ich diese Fragestellung adressiert und mikrofluidische als auch holographische Techniken entwickelt und angewendet, um viskoelastische Eigenschaften von Einzelzellen bzw. mehrzelligen Aggregaten zu analysieren. Zunächst habe ich gezeigt, dass die Verformbarkeitszytometrie in Echtzeit (real-time deformability cytometry, RT-DC) in der Transfusionsmedizin angewendet werden kann, wo höchste Qualitätsstandards eingehalten werden müssen, während die Freigabe der Blutprodukte zeitkritisch ist. Wir konnten für Thrombozyten- und Erythrozytenkonzentrate sowie für hämatopoetische Stammzellen zeigen, dass deren mechanische Eigenschaften zur markierungsfreien Qualitätsbewertung herangezogen werden können. Die Ergebnisse wurden im Journal Lab on a Chip veröffentlicht (Aurich et al. 2020). Für RT-DC und viele andere Methoden, die auf hydrodynamischer Verformung basieren, muss die Kanalgröße an die der Objekte angepasst werden, um eine Verformung durch Scherkräfte zu ermöglichen. Wir haben das Konzept der virtuellen Fluidkanäle eingeführt, welche durch zwei wässrige Polymerlösungen gebildet werden, bei dem ein Strom den anderen einhüllt. Virtuelle Fluidkanäle können in ihrem Querschnitt präzise eingestellt werden und ermöglichen die mechanische Phänotypisierung von Einzelzellen sowie Zellverbänden oder Gewebe-Sphäroiden in einem mikrofluidischen System. Eine Stärke der Methode ist, dass Messungen auch in mikrofluidischen Standardgeometrien jenseits von abgegossenen Kanälen basierend auf Lithographie durchgeführt werden können, z. B. in der Küvette eines Durchflusszytometers. Für Zell-Sphäroide als ein Modellsystem für mehrzellige Aggregate messen wir ein 10-fach niedrigeres Elastizitätsmodul des Gewebes im Vergleich zur Einzelzellmechanik, was darauf hindeutet, dass Zell-Zell- und Zell-Matrix-Wechselwirkungen potenzielle Beiträge zur Mechanik mehrzelliger Aggregate leisten. Unsere Arbeit zu virtuellen Fluidkanälen wurde in Nature Communications veröffentlicht (Panhwar et al. 2020). Im Rahmen dieser Arbeit entwickelte ich die dynamische Verformbarkeitszytometrie in Echtzeit (dynamic real-time deformability cytometry, dRT-DC), welche die elastische Phänotypisierung von RT-DC hin zur Hochdurchsatz-Messung viskoelastischer Zelleigenschaften erweitert. Die dynamische Verfolgung von Zellen beim Passieren der mikrofluidischen Kanäle ermöglicht sowohl die Quantifizierung stationärer (Elastizität) als auch zeitabhängiger (Viskosität) Materialeigenschaften für eine vollständige, viskoelastische Charakterisierung von Suspensionszellen bei hohem Durchsatz. Ich führte eine Zerlegung in Moden der geometrischen Form basierend auf einer Fourier-Transformation ein, welche es ermöglicht, die überlagerten Dehnungsantworten auf eine Streckspannung am Kanaleingang und den konstanten Scherstress innerhalb des Kanals zu unterscheiden. Beide hydrodynamischen Stressverteilungen sind in nahezu jeder mikrofluidischen Kanalgeometrie vorhanden. Aus den separierten Stressantworten können viskoelastische Materialeigenschaften unabhängig von der Zellform bestimmt werden. In Experimenten haben wir die Sensitivität von dRT-DC hinsichtlich Veränderungen des Zytoskellets demonstriert und die extrahierten Materialeigenschaften durch Referenzmessungen an kalibrierten Hydrogelkugeln bestätigt. In unserer Arbeit präsentieren wir zudem die viskoelastischen Eigenschaften der wichtigsten Subpopulationen des peripheren Blutes: Erythrozyten, Granulozyten und mononukleäre Blutzellen (PBMCs) (z. B. Lymphozyten und Monozyten). Die viskoelastischen Eigenschaften aller Subpopulationen wurden mit derselben Methode charakterisiert und können wie ein mechanischer Fingerabdruck interpretiert werden. Die Methode sowie die Ergebnisse wurden im Journal Nature Communications veröffentlicht (Fregin et al. 2019). Bei zellmechanischen Verfahren, die auf hydrodynamischer Verformung basieren, wird zumeist die Form bzw. Dehnung der Zelle beobachtet, während ein Stress aufgeprägt wird. Für die Ableitung von Materialeigenschaften sowie die Untersuchung der Dynamik der Verformung ist es wichtig, die Zellform mit höchster Sensitivität bezüglich Unterschiede in deren Dehnung unter gegebenen Randbedingungen, wie dem mikrofluidischen System und der experimentellen Umgebung, zu beschreiben. Unter Verwendung von dRT-DC habe ich neun verschiedene Formparameter verglichen, um die Zellverformung sowohl unter Streckspannung als auch unter Scherstress zu analysieren. Eine Relaxationszeitanalyse wurde auf verschiedenen Ebenen der Datenaggregation von Einzelzellen bis hin zum Ensemble durchgeführt. Ich habe gezeigt, dass die stationäre Verformung aus Stressantwortkurven vorhergesagt werden kann, ohne dass sie den stationären Zustand erreichen. Dies ist für zellmechanische Messungen in mikrofluidischen Systemen von Bedeutung, da die charakteristischen Zeiten im Allgemeinen unbekannt sind und die Kanallänge festgelegt ist. Darüber hinaus kann durch die Einführung eines Kriteriums, welches garantiert, dass ein Mindestmaß der Stressantwortkurve innerhalb des Kanals aufgenommen wird, die Analysezeit pro Zelle reduziert und dennoch Materialeigenschaften extrahiert werden. In Simulationen verglich ich die Genauigkeit der Relaxationszeiten, welche aus Ensemble- und Einzelzellstudien extrahiert wurden. Durch die Einführung eines Bewertungssystems, welches einschätzt, welche Kombination aus Formparametern und Analysestrategien die größte Effektstärke bereitstellt, kamen wir zu dem Schluss, dass Einzelzellanalysen unter Streckspannung unabhängig von der Parametrisierung der Form am empfindlichsten auf Änderungen des Zytoskeletts reagieren. Das Manuskript wurde beim Biophysical Journal eingereicht. Schließlich übertrug ich die schnelle kontaktlose zellmechanische Charakterisierung von Suspensionszellen auf adhärente Zellen. Eine solche Messtechnik war bisher nicht verfügbar. Da die Mehrheit der Zellen adhärent ist, ist eine robuste, markierungsfreie Methode zur Mechanophänotypisierung mit hohem Durchsatz von hoher Bedeutung. Im Rahmen dieser Arbeit habe ich ein neues Konzept eingeführt und implementiert: die holographische Vibrationsspektroskopie (holographic vibration spectroscopy, HVS), bei welcher adhärente Zellen auf einer vibrierenden Oberfläche mechanisch angeregt werden, während deren Oszillationen optisch gemessen werden. Die Analyse erfolgt in einem interferometrischen, heterodynen Aufbau unter Verwendung von Frequenzmultiplexing und zeitgemittelter Holographie in Off-axis-Konfiguration. Basierend auf Interferenzbildern, die von einer Hochgeschwindigkeitskamera (CMOS) aufgenommen wurden, habe ich ein mathematisches Modell erstellt, um die Schwingungsamplitude adhärenter Zellen sowie deren Phasenverzögerung gegenüber der anregenden Schwingung zu rekonstruieren. Aus dem Amplituden- und Phasengang lassen sich viskoelastische Parameter ableiten, die in Folgestudien untersucht werden müssen. Innerhalb meiner Doktorarbeit habe ich zwei Hochdurchsatzmethoden zur viskoelastischen Charakterisierung von Suspensionszellen sowie adhärenten Zellen eingeführt und zugleich Anwendungen in der Gewebemechanik und Transfusionsmedizin aufgezeigt, die nicht nur in der Grundlagenforschung, sondern auch in der translationalen Forschung relevant sind.